Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb eredmény elérése érdekében újabb böngésző használatát javasoljuk (vagy a kompatibilitási mód letiltását az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A modikus változás (MC) állatmodelljeinek létrehozása fontos alapja az MC tanulmányozásának. Ötvennégy új-zélandi fehér nyulat osztottunk ál-műtétes csoportba, izombeültetéses csoportba (ME csoport) és nucleus pulposus implantációs csoportba (NPE csoport). Az NPE csoportban az intervertebrális porckorongot anterolaterális ágyéki sebészeti megközelítéssel tártuk fel, és egy tűt használtunk az L5 csigolyatest átszúrására a véglemez közelében. Az NP-t fecskendővel eltávolítottuk az L1/2 intervertebrális porckorongból, és beleinjekcióztuk. Lyukat fúrtunk a porc alatti csontba. Az izombeültetéses csoportban és az ál-műtétes csoportban a sebészeti eljárások és a fúrási módszerek megegyeztek az NP beültetéses csoportban alkalmazottakkal. Az ME csoportban egy izomdarabot helyeztünk a lyukba, míg az ál-műtétes csoportban semmit sem helyeztünk a lyukba. A műtét után MRI vizsgálatot és molekuláris biológiai vizsgálatokat végeztünk. Az NPE csoportban a jel megváltozott, de az ál-műtétes csoportban és az ME csoportban nem volt nyilvánvaló jelváltozás. A szövettani vizsgálat kimutatta, hogy a beültetés helyén rendellenes szövetproliferációt figyeltek meg, és az IL-4, IL-17 és IFN-γ expressziója fokozott volt az NPE csoportban. Az NP beültetése a porc alatti csontba az MC állatmodelljét alkothatja.
A modikus elváltozások (MC) a csigolyavéglemezek és a szomszédos csontvelő elváltozásai, amelyek láthatók a mágneses rezonancia képalkotáson (MRI). Meglehetősen gyakoriak a kapcsolódó tünetekkel rendelkező egyéneknél1. Számos tanulmány hangsúlyozta az MC fontosságát az alsó hátfájással (LBP) való összefüggése miatt2,3. de Roos és munkatársai4, valamint Modic és munkatársai5 egymástól függetlenül elsőként írtak le három különböző típusú szubkondrális jelátviteli rendellenességet a csigolyavéglemezekben. Az I. típusú modikus elváltozások hipointenzívek a T1 súlyozott (T1W) szekvenciákon és hiperintenzívek a T2 súlyozott (T2W) szekvenciákon. Ez az elváltozás fissúrás véglemezeket és a szomszédos vaszkuláris granulációs szövetet mutat a csontvelőben. A II. típusú modikus elváltozások magas jelet mutatnak mind a T1W, mind a T2W szekvenciákon. Ebben a típusú elváltozásban a véglemezek károsodása, valamint a szomszédos csontvelő szövettani zsíros helyettesítése is megfigyelhető. A III. típusú modikus elváltozások alacsony jelet mutatnak a T1W és T2W szekvenciákon. A véglemezeknek megfelelő szklerotikus elváltozásokat is megfigyeltek6. Az MC-t a gerinc kóros betegségének tekintik, és szorosan összefügg számos degeneratív gerincbetegséggel7,8,9.
A rendelkezésre álló adatok alapján számos tanulmány részletes betekintést nyújtott az MC etiológiájába és kóros mechanizmusaiba. Albert és munkatársai szerint az MC-t porckorongsérv okozhatja8. Hu és munkatársai az MC-t súlyos porckorongdegenerációnak tulajdonították10. Kroc a „belső porckorongszakadás” koncepcióját javasolta, amely kimondja, hogy az ismétlődő porckorongsérv mikroszakadásokhoz vezethet a zárólemezben. A hasadék kialakulása után a zárólemez nucleus pulposus (NP) általi károsodása autoimmun választ válthat ki, ami tovább vezet az MC11 kialakulásához. Ma és munkatársai hasonló nézetet osztottak, és arról számoltak be, hogy az NP által kiváltott autoimmunitás kulcsszerepet játszik az MC12 patogenezisében.
Az immunrendszer sejtjei, különösen a CD4+ T helper limfociták, kritikus szerepet játszanak az autoimmunitás patogenezisében13. A nemrég felfedezett Th17 alcsoport termeli a gyulladáskeltő IL-17 citokint, elősegíti a kemokin expresszióját, és serkenti a sérült szervekben lévő T-sejteket IFN-γ termelésére14. A Th2 sejtek szintén egyedülálló szerepet játszanak az immunválaszok patogenezisében. Az IL-4 expressziója reprezentatív Th2 sejtként súlyos immunpatológiai következményekhez vezethet15.
Bár számos klinikai vizsgálatot végeztek az MC-vel16,17,18,19,20,21,22,23,24, még mindig hiányoznak a megfelelő állatkísérleti modellek, amelyek utánoznák az emberekben gyakran előforduló MC folyamatot, és felhasználhatók lennének az etiológia vagy új kezelések, például a célzott terápia vizsgálatára. A mai napig csak néhány MC állatmodellről számoltak be, amelyek a mögöttes kóros mechanizmusokat tanulmányozzák.
Albert és Ma autoimmun elméletére alapozva, ez a tanulmány egy egyszerű és reprodukálható nyúl MC modellt hozott létre az NP autotranszplantációjával a fúrt csigolyavégződés közelébe. További célok az állatmodellek szövettani jellemzőinek megfigyelése és az NP specifikus mechanizmusainak értékelése az MC kialakulásában. Ennek érdekében olyan technikákat alkalmazunk, mint a molekuláris biológia, az MRI és a szövettani vizsgálatok az MC progressziójának tanulmányozására.
Két nyúl vérzés következtében pusztult el a műtét során, négy pedig az MRI vizsgálat alatti altatás alatt. A fennmaradó 48 nyúl túlélte, és a műtét után semmilyen viselkedési vagy neurológiai tünetet nem mutatott.
Az MRI azt mutatja, hogy a különböző lyukakba beágyazott szövet jelintenzitása eltérő. Az NPE csoportban az L5 csigolyatest jelintenzitása fokozatosan változott a behelyezés után 12, 16 és 20 héttel (a T1W szekvencia alacsony jelet, a T2W szekvencia pedig vegyes jelet és alacsony jelet mutatott) (1C. ábra), míg a másik két beágyazott csoport MRI-megjelenése viszonylag stabil maradt ugyanezen időszak alatt (1A., B. ábra).
(A) A nyúl ágyéki gerincének reprezentatív szekvenciális MRI-felvételei 3 időpontban. Az ál-műtétes csoport képein nem találtak jelbeli rendellenességeket. (B) A csigolyatest jeljellemzői az ME csoportban hasonlóak az ál-műtétes csoportéhoz, és a beágyazási helyen nem figyeltek meg szignifikáns jelváltozást az idő múlásával. (C) Az NPE csoportban az alacsony jel jól látható a T1W szekvenciában, a vegyes jel és az alacsony jel pedig jól látható a T2W szekvenciában. A 12 hetes időszaktól a 20 hetes időszakig a T2W szekvenciában az alacsony jeleket körülvevő szórványos magas jelek csökkennek.
Az NPE csoportban a csigolyatest beültetési helyén egyértelműen megfigyelhető csonthiperplázia, és a csonthiperplázia 12 és 20 hét között gyorsabban jelentkezik (2C. ábra) az NPE csoporthoz képest, a modellezett csigolyatestekben nem figyeltek meg szignifikáns változást; Sham csoport és ME csoport (2C. ábra 2A,B).
(A) A csigolyatest felszíne a beültetett részen nagyon sima, a lyuk jól gyógyul, és a csigolyatestben nincs hiperplázia. (B) A beültetett hely alakja az ME csoportban hasonló az áloperált csoportéhoz, és az beültetett hely megjelenésében idővel nem tapasztalható szembetűnő változás. (C) Az NPE csoportban a beültetett helyen csonthiperplázia fordult elő. A csonthiperplázia gyorsan növekedett, sőt a csigolyaközi porckorongon keresztül az ellenoldali csigolyatestre is kiterjedt.
A szövettani elemzés részletesebb információkat nyújt a csontképződésről. A 3. ábra a H&E-vel festett posztoperatív metszetek fényképeit mutatja. Az ál-műtéten átesett csoportban a porcsejtek jól elrendeződtek, és nem észleltek sejtszaporodást (3A. ábra). Az ME csoportban a helyzet hasonló volt az ál-műtéten átesett csoporthoz (3B. ábra). Az NPE csoportban azonban nagyszámú porcsejtet és NP-szerű sejtek proliferációját figyelték meg a beültetés helyén (3C. ábra);
(A) A véglemez közelében trabekulák láthatók, a porcsejtek szépen elrendeződtek, egyenletes sejtmérettel és -formával, proliferáció nélkül (40-szeres). (B) Az implantációs hely állapota az ME csoportban hasonló az ál-csoportéhoz. Trabekulák és porcsejtek láthatók, de a beültetés helyén nincs szembetűnő proliferáció (40-szeres). (B) Látható, hogy a porcsejtek és az NP-szerű sejtek jelentősen proliferálnak, a porcsejtek alakja és mérete egyenetlen (40-szeres).
Az interleukin 4 (IL-4) mRNS, az interleukin 17 (IL-17) mRNS és az interferon γ (IFN-γ) mRNS expresszióját mind az NPE, mind az ME csoportban megfigyelték. A célgének expressziós szintjének összehasonlításakor az IL-4, IL-17 és IFN-γ génexpressziója szignifikánsan magasabb volt az NPE csoportban az ME csoporthoz és az áloperált csoporthoz képest (4. ábra) (P < 0,05). Az áloperált csoporthoz képest az IL-4, IL-17 és IFN-γ expressziós szintje az ME csoportban csak kis mértékben emelkedett, és nem érte el a statisztikai változást (P > 0,05).
Az IL-4, IL-17 és IFN-γ mRNS expressziója az NPE csoportban szignifikánsan magasabb tendenciát mutatott, mint az áloperált csoportban és az ME csoportban (P < 0,05).
Ezzel szemben az ME csoport expressziós szintjei nem mutattak szignifikáns különbséget (P>0,05).
A megváltozott mRNS expressziós mintázat megerősítésére Western blot analízist végeztünk IL-4 és IL-17 elleni kereskedelmi forgalomban kapható antitestekkel. Amint az 5A és 5B ábrákon látható, az NPE csoportban az IL-4 és IL-17 fehérjeszintje szignifikánsan magasabb volt az ME csoporthoz és az áloperált csoporthoz képest (P < 0,05). Az áloperált csoporthoz képest az ME csoportban az IL-4 és IL-17 fehérjeszintjei sem értek el statisztikailag szignifikáns változásokat (P > 0,05).
(A) Az IL-4 és IL-17 fehérjeszintjei az NPE csoportban szignifikánsan magasabbak voltak, mint az ME csoportban és a placebo csoportban (P < 0,05). (B) Western blot hisztogram.
A műtétek során nyert korlátozott számú emberi minta miatt az MC patogenezisének egyértelmű és részletes vizsgálata némileg nehézkes. Kísérletet tettünk egy állatmodell létrehozására az MC lehetséges kóros mechanizmusainak tanulmányozására. Ugyanakkor radiológiai, szövettani és molekuláris biológiai vizsgálatokat alkalmaztunk az NP autograft által kiváltott MC lefolyásának követésére. Ennek eredményeként az NP implantációs modell a jelintenzitás fokozatos változását eredményezte a 12. és 20. hét közötti időpontokban (vegyes alacsony jel a T1W szekvenciákban és alacsony jel a T2W szekvenciákban), ami szöveti elváltozásokra utal, és a szövettani, valamint molekuláris biológiai vizsgálatok megerősítették a radiológiai vizsgálat eredményeit.
A kísérlet eredményei azt mutatják, hogy vizuális és szövettani változások történtek a csigolyasérülés helyén az NPE csoportban. Ugyanakkor az IL-4, IL-17 és IFN-γ gének, valamint az IL-4, IL-17 és IFN-γ expresszióját figyelték meg, ami arra utal, hogy az autológ nucleus pulposus szövet sérülése a csigolyatestben számos jel- és morfológiai változást okozhat. Könnyen megállapítható, hogy az állatmodell csigolyatesteinek jeljellemzői (alacsony jel a T1W szekvenciában, vegyes jel és alacsony jel a T2W szekvenciában) nagyon hasonlóak az emberi csigolyasejtekéhez, és az MRI-jellemzők is megerősítik a szövettani és makroszkopikus anatómiai megfigyeléseket, azaz a csigolyatestsejtekben bekövetkező változások progresszívek. Bár az akut trauma okozta gyulladásos válasz a punkció után hamarosan megjelenhet, az MRI-eredmények azt mutatták, hogy a progresszíven növekvő jelváltozások a punkció után 12 héttel megjelentek, és akár 20 hétig is fennálltak anélkül, hogy a felépülés vagy az MRI-változások visszafordulásának jelei mutatkoztak volna. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az autológ csigolya NP megbízható módszer a progresszív MV létrehozására nyulakban.
Ez a punkciós modell megfelelő szakértelmet, időt és sebészeti erőfeszítést igényel. Az előzetes kísérletekben a paravertebrális szalagszerkezetek boncolása vagy túlzott stimulációja csigolya osteophyták kialakulásához vezethet. Ügyelni kell arra, hogy ne sértsük meg vagy irritáljuk a szomszédos porckorongokat. Mivel a behatolási mélységet szabályozni kell az egységes és reprodukálható eredmények elérése érdekében, manuálisan készítettünk egy dugót egy 3 mm hosszú tű hüvelyének levágásával. Ennek a dugónak a használata biztosítja az egyenletes fúrási mélységet a csigolyatestben. Előzetes kísérletekben a műtétben részt vevő három ortopéd sebész úgy találta, hogy a 16-os méretű tűkkel könnyebb dolgozni, mint a 18-as méretűekkel vagy más módszerekkel. A fúrás közbeni túlzott vérzés elkerülése érdekében a tű egy ideig mozdulatlanul tartása megfelelőbb behelyezési lyukat biztosít, ami arra utal, hogy az MC bizonyos mértékű szabályozható ilyen módon.
Bár számos tanulmány célozta meg az MC-t, keveset tudunk az MC etiológiájáról és patogeneziséről25,26,27. Korábbi tanulmányaink alapján megállapítottuk, hogy az autoimmunitás kulcsszerepet játszik az MC12 előfordulásában és kialakulásában. Ez a tanulmány az IL-4, IL-17 és IFN-γ kvantitatív expresszióját vizsgálta, amelyek a CD4+ sejtek fő differenciálódási útvonalai antigén stimuláció után. Tanulmányunkban a negatív csoporthoz képest az NPE csoportban magasabb volt az IL-4, IL-17 és IFN-γ expressziója, és az IL-4 és IL-17 fehérjeszintjei is magasabbak voltak.
Klinikailag az IL-17 mRNS expressziója fokozott a porckorongsérvvel rendelkező betegek NP-sejtjeiben28. Egy akut, nem kompresszív porckorongsérv-modellben is megnövekedett IL-4 és IFN-γ expressziós szinteket találtak az egészséges kontrollokhoz képest29. Az IL-17 kulcsszerepet játszik a gyulladásban és az autoimmun betegségek szövetkárosodásában30, és fokozza az IFN-γ-ra adott immunválaszt31. Fokozott IL-17 által közvetített szövetkárosodásról számoltak be MRL/lpr egerekben32 és autoimmunitásra fogékony egerekben33. Az IL-4 gátolhatja a gyulladáskeltő citokinek (például IL-1β és TNFα) expresszióját és a makrofágok aktivációját34. A jelentések szerint az IL-4 mRNS expressziója eltérett az NPE csoportban az IL-17 és az IFN-γ azonos időpontbeli expressziójához képest; Az IFN-γ mRNS expressziója az NPE csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint a többi csoportban. Ezért az IFN-γ termelés az NP interkalációja által kiváltott gyulladásos válasz mediátora lehet. Tanulmányok kimutatták, hogy az IFN-γ-t több sejttípus termeli, beleértve az aktivált 1-es típusú helper T-sejteket, a természetes ölősejteket és a makrofágokat35,36, és ez egy kulcsfontosságú gyulladáskeltő citokin, amely elősegíti az immunválaszokat37.
Ez a tanulmány arra utal, hogy az autoimmun válasz szerepet játszhat az MC előfordulásában és fejlődésében. Luoma és munkatársai azt találták, hogy az MC és a kiemelkedő NP jeljellemzői hasonlóak az MRI-n, és mindkettő magas jelet mutat a T2W szekvenciában38. Egyes citokinekről kimutatták, hogy szorosan összefüggenek az MC előfordulásával, mint például az IL-139. Ma és munkatársai azt feltételezték, hogy az NP felfelé vagy lefelé történő kiemelkedése nagy hatással lehet az MC12 előfordulására és fejlődésére. Bobechko40 és Herzbein és munkatársai41 arról számoltak be, hogy az NP egy immuntoleráns szövet, amely születésétől fogva nem tud bejutni az érrendszerbe. Az NP kiemelkedései idegen testeket juttatnak a vérellátásba, ezáltal lokális autoimmun reakciókat közvetítve42. Az autoimmun reakciók számos immunfaktort indukálhatnak, és amikor ezek a faktorok folyamatosan ki vannak téve a szöveteknek, változásokat okozhatnak a jelátvitelben43. Ebben a vizsgálatban az IL-4, az IL-17 és az IFN-γ túltermelése tipikus immunfaktorok, ami tovább bizonyítja az NP és az MC-k közötti szoros kapcsolatot44. Ez az állatmodell jól utánozza az NP áttörését és bejutását a véglemezbe. Ez a folyamat tovább tárta fel az autoimmunitás MC-re gyakorolt hatását.
Ahogy az várható volt, ez az állatmodell egy lehetséges platformot biztosít az MC tanulmányozásához. A modellnek azonban továbbra is vannak korlátai: egyrészt az állatmegfigyelési fázisban néhány köztes stádiumú nyulat el kell altatni szövettani és molekuláris biológiai vizsgálatokhoz, így egyes állatok idővel „kiesnek a használatból”. Másodszor, bár ebben a tanulmányban három időpontot tűztünk ki, sajnos csak egy típusú MC-t modelleztünk (Modic I. típusú változás), így ez nem elegendő az emberi betegségfejlődési folyamat ábrázolásához, és több időpontot kell meghatározni az összes jelváltozás jobb megfigyelése érdekében. Harmadszor, a szövetszerkezet változásai valóban egyértelműen kimutathatók szövettani festéssel, de néhány speciális technika jobban feltárhatja a mikrostrukturális változásokat ebben a modellben. Például polarizált fénymikroszkópiát alkalmaztak a fibroporc kialakulásának elemzésére nyúl porckorongokban45. Az NP MC-re és a zárólemezre gyakorolt hosszú távú hatásai további vizsgálatokat igényelnek.
Ötvennégy hím új-zélandi fehér nyulat (súlyuk körülbelül 2,5-3 kg, életkoruk 3-3,5 hónap) véletlenszerűen osztottunk áloperációs csoportba, izombeültetéses csoportba (ME csoport) és ideggyökér-beültetéses csoportba (NPE csoport). Minden kísérleti eljárást a Tiencsini Kórház Etikai Bizottsága hagyott jóvá, és a kísérleti módszereket szigorúan a jóváhagyott irányelveknek megfelelően végeztük.
S. Sobajima sebészeti technikáján néhány fejlesztés történt.46 Minden nyulat oldalfekvő helyzetbe helyeztek, és öt egymást követő ágyéki porckorong (IVD) elülső felszínét posterolaterális retroperitoneális megközelítéssel tárták fel. Minden nyulat általános érzéstelenítésben részesítettek (20% uretán, 5 ml/kg a fülvénán keresztül). A bordák alsó szélétől a medenceperemig hosszanti bőrmetszést ejtettek, 2 cm-re a paravertebrális izmoktól hasi oldalon. A jobb oldali anterolaterális gerincet L1-től L6-ig a felette lévő bőr alatti szövet, a retroperitoneális szövet és az izmok éles és tompa preparálásával tárták fel (6A. ábra). A porckorong szintjét a medenceperemet használva határozták meg az L5-L6 porckorong szintjének anatómiai tájékozódási pontjaként. 16-os méretű punkciós tűvel fúrtak egy 3 mm mély lyukat az L5 csigolya véglapjának közelében (6B. ábra). Egy 5 ml-es fecskendővel szívjuk ki az L1-L2 csigolyaközi porckorongban található autológ nucleus pulposust (6C. ábra). Az egyes csoportok igényeinek megfelelően távolítsuk el a nucleus pulposust vagy az izmot. A fúrólyuk elmélyítése után felszívódó varratokat helyezünk a mély fasciára, a felszínes fasciára és a bőrre, ügyelve arra, hogy a műtét során ne sértsük meg a csigolyatest periosteális szövetét.
(A) Az L5–L6 porckorongot posterolaterális retroperitoneális megközelítéssel szabadítják fel. (B) 16-os méretű tűvel fúrnak lyukat az L5 zárólemezének közelében. (C) Autológ MF-eket gyűjtenek.
Az altatást 20%-os uretánnal (5 ml/kg) végezték a fülvénán keresztül, és a műtét után 12, 16 és 20 héttel megismételték az ágyéki gerinc röntgenfelvételeit.
A műtét utáni 12., 16. és 20. héten a nyulakat intramuszkuláris ketamin (25,0 mg/kg) és intravénás nátrium-pentobarbitál (1,2 g/kg) injekcióval ölték meg. A teljes gerincet eltávolították szövettani elemzés céljából, és valódi analízist végeztek. Az immunfaktorok változásainak kimutatására kvantitatív reverz transzkripciót (RT-qPCR) és Western blot analízist alkalmaztak.
Az MRI vizsgálatokat nyulakon 3,0 T klinikai mágnessel (GE Medical Systems, Florence, SC) végezték, amely ortogonális végtagtekercs-vevővel volt felszerelve. A nyulakat 20%-os uretánnal (5 ml/kg) altatták a fülvénán keresztül, majd hanyatt fektették a mágnesbe, az ágyéki régiót egy 5 hüvelyk átmérőjű kör alakú felszíni tekercsre (GE Medical Systems) helyezve. Koronális T2 súlyozott lokalizációs képeket (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) készítettek az ágyéki porckorong L3-L4 és L5-L6 közötti helyzetének meghatározásához. Sagittális síkú T2 súlyozott szeleteket készítettek a következő beállításokkal: gyors spin-visszhang szekvencia 2200 ms ismétlési idővel (TR) és 70 ms visszhangidővel (TE), mátrix; 260 látómező és nyolc inger; a vágási vastagság 2 mm, a rés 0,2 mm volt.
Miután elkészítették az utolsó fényképet és az utolsó nyúl leölték, a ál-, az izomba ágyazott és az NP-korongokat szövettani vizsgálat céljából eltávolították. A szöveteket 1 hétig 10%-os semleges pufferolt formalinban fixálták, etilén-diamin-tetraecetsavval dekalcifálták, majd paraffinból metszeteket készítettek. A szövetblokkokat paraffinba ágyazták, és mikrotóm segítségével sagittális metszeteket (5 μm vastag) készítettek belőlük. A metszeteket hematoxilin-eozinnal (H&E) festették.
Miután minden csoportban begyűjtöttük a nyulak csigolyaközi porckorongjait, teljes RNS-t extraháltunk UNIQ-10 oszlop (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Kína) segítségével a gyártó utasításai szerint, valamint egy ImProm II reverz transzkripciós rendszer (Promega Inc., Madison, WI, USA) segítségével. Reverz transzkripciót végeztünk.
Az RT-qPCR-t Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) és SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) felhasználásával végeztük a gyártó utasításai szerint. A PCR reakciótérfogat 20 μl volt, és 1,5 μl hígított cDNS-t és 0,2 μM primert tartalmazott. A primereket az OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) tervezte, és a Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Kína) gyártotta (1. táblázat). A következő termikus ciklusfeltételeket alkalmaztuk: kezdeti polimeráz aktiválási lépés 94°C-on 2 percig, majd 40 ciklus, egyenként 15 másodpercig 94°C-on a templát denaturálásához, 1 perces hőkezelés 60°C-on, extenzió és fluoreszcencia. A méréseket 1 percig 72°C-on végeztük. Minden mintát háromszor amplifikáltunk, és az átlagértéket használtuk az RT-qPCR elemzéshez. Az amplifikációs adatokat FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) szoftverrel elemeztük. Az IL-4, IL-17 és IFN-γ génexpressziót az endogén kontrollhoz (ACTB) normalizáltuk. A cél mRNS relatív expressziós szintjét a 2-ΔΔCT módszerrel számítottuk ki.
A teljes fehérjét RIPA lízispufferben (proteáz és foszfatáz inhibitor koktélt tartalmazott) szövethomogenizátorral extraháltuk a szövettörmelék eltávolítása érdekében, majd 13 000 fordulat/perc sebességgel 20 percig 4°C-on centrifugáltuk a szövettörmelék eltávolítása érdekében. Sávonként ötven mikrogramm fehérjét vittünk fel, 10%-os SDS-PAGE-val választottuk el, majd PVDF membránra vittük át. A blokkolást 5%-os zsírszegény tejporban, 0,1% Tween 20-at tartalmazó Tris-pufferolt sóoldatban (TBS) végeztük 1 órán át szobahőmérsékleten. A membránt nyúl anti-dekorin primer antitesttel (1:200 hígításban; Boster, Wuhan, Kína) (1:200 hígításban; Bioss, Peking, Kína) inkubáltuk egy éjszakán át 4°C-on, majd a második napon torma-peroxidázzal (Boster, Wuhan, Kína) kombinált szekunder antitesttel (kecske anti-nyúl immunglobulin G 1:40 000 hígításban) reagáltattuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A Western blot jeleket a röntgenbesugárzás utáni kemilumineszcencia növekedésével detektáltuk a kemilumineszcens membránon. Denzitometriás analízishez a blotokat szkenneltük és BandScan szoftverrel számszerűsítettük, és az eredményeket a célgén immunreaktivitásának és a tubulin immunreaktivitásának arányaként fejeztük ki.
A statisztikai számításokat az SPSS16.0 szoftvercsomaggal (SPSS, USA) végeztük. A vizsgálat során gyűjtött adatokat átlag ± szórás (átlag ± SD) formájában fejeztük ki, és egyutas ismételt méréses varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük a két csoport közötti különbségek meghatározására. A P < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
Így az MC állatmodelljének létrehozása autológ NP-k csigolyatestbe történő beültetésével, valamint makroanatómiai megfigyelés, MRI-analízis, szövettani értékelés és molekuláris biológiai elemzés elvégzésével fontos eszközzé válhat az emberi MC mechanizmusainak felmérésében és megértésében, valamint új terápiás beavatkozások kidolgozásában.
Hogyan idézzük ezt a cikket: Han, C. et al. A Modic-változások állatmodelljét autológ nucleus pulposus beültetésével hozták létre az ágyéki gerinc szubkondrális csontjába. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. és Boos, N. Az ágyéki gerinc mágneses rezonancia képalkotása: porckorongsérv és -retenció, ideggyökér-kompresszió, zárólemez-rendellenességek és fasettízületi osteoarthritis prevalenciája tünetmentes önkénteseknél. Radiológia 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, és Leboeuf-Eed, K. Módikus változások és kapcsolatuk a klinikai eredményekkel. European Spine Journal: az Európai Gerinc Társaság, az Európai Gerincdeformitási Társaság és az Európai Nyaki Gerinckutató Társaság hivatalos kiadványa 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. és munkatársai. Az ágyéki csigolyák véglemezeinek modikus változásai: prevalencia és összefüggés a derékfájdalommal és az isiászsal középkorú férfi munkavállalóknál. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. és Dalinka, M. A csontvelő MRI-vizsgálata a véglemez közelében az ágyéki gerinc degeneratív betegségében. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ és Carter, JR Degeneratív porckorongbetegség: a csigolyavelő-elváltozások MRI-vel történő értékelése. Radiológia 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS és Carter, JR. Degeneratív porckorongbetegség képalkotása. Radiológia 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS és munkatársai. A neovertebrális véglemez (Modic) jelváltozásainak előrejelzői az általános populációban. European Spine Journal: Az Európai Gerinc Társaság, az Európai Gerincdeformitási Társaság és az Európai Nyakgerinc-kutató Társaság hivatalos kiadványa, 19. osztály, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB és Mannisch, K. Módikus változások ágyéki porckorongsérv után. European Spine Journal: Az Európai Gerinc Társaság, az Európai Gerincdeformitási Társaság és az Európai Nyaki Gerinckutató Társaság hivatalos kiadványa 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., és Kaapa, E. A modikus I. típusú változások előre jelezhetik a gyorsan progresszív deformációs porckorong degenerációt: egy 1 éves prospektív vizsgálat. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ és Fan, SW. Modikus változások: lehetséges okok és hozzájárulásuk az ágyéki porckorong degenerációhoz. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Belső porckorongszakadás. Porckorongsüllyedési problémák 50 év felett. Gerinc (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Közzététel ideje: 2024. dec. 13.