• mi

Autológ nucleus pulposus ágyéki subchondralis csontba ültetett, hogy létrehozzák a Modic változások állatmodelljét

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb eredmény érdekében javasoljuk, hogy használjon újabb böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A modikus változás (MC) állatmodelljeinek felállítása fontos alapja az MC tanulmányozásának. Ötvennégy új-zélandi fehér nyulat álműtéti csoportra, izombeültetési csoportra (ME csoport) és nucleus pulposus implantációs csoportra (NPE csoport) osztottak. Az NPE csoportban az intervertebralis porckorongot anterolaterális lumbális sebészeti megközelítéssel szabadították fel, és tűvel szúrták meg az L5 csigolyatestet a véglemez közelében. Az L1/2 csigolyaközi lemezből fecskendővel extraháltuk az NP-t és abba fecskendeztük. Lyuk fúrása a subchondralis csontba. A műtéti eljárások és fúrási módszerek az izombeültetési csoportban és az álműtétes csoportban megegyeztek az NP beültetési csoportban alkalmazottakkal. Az ME csoportban egy izomdarabot helyeztek a lyukba, míg az álműtétes csoportban semmit sem helyeztek a lyukba. A műtét után MRI szkennelés és molekuláris biológiai vizsgálat történt. Az NPE csoport jele megváltozott, de nem volt nyilvánvaló jelváltozás az ál-műtét csoportban és az ME csoportban. A szövettani megfigyelések azt mutatták, hogy a beültetés helyén kóros szöveti proliferációt figyeltek meg, és az IL-4, IL-17 és IFN-γ expressziója megnövekedett az NPE csoportban. Az NP beültetése a subchondralis csontba az MC állatmodelljét képezheti.
A módosult változások (MC) a csigolya véglemezeinek és a szomszédos csontvelőnek a mágneses rezonancia képalkotáson (MRI) látható elváltozásai. Meglehetősen gyakoriak a kapcsolódó tünetekkel rendelkező egyéneknél1. Számos tanulmány hangsúlyozta az MC jelentőségét a derékfájással (LBP) való kapcsolata miatt2,3. de Roos és munkatársai 4 és Modic és mtsai 5 egymástól függetlenül először három különböző típusú szubchondrális jelrendellenességet írtak le a csigolya csontvelőjében. A modikus I. típusú változások a T1-súlyozott (T1W) szekvenciákon hipointenzívek, a T2-súlyozott (T2W) szekvenciákon pedig hiperintenzívek. Ez az elváltozás felfedi a repedések véglemezeit és a szomszédos vaszkuláris granulációs szöveteket a csontvelőben. A II. típusú módosítások magas jelet mutatnak mind a T1W, mind a T2W szekvenciákon. Az ilyen típusú elváltozásoknál a véglemez destrukció, valamint a szomszédos csontvelő szövettani zsírpótlása található. A Modic III típusú változtatások alacsony jelet mutatnak a T1W és T2W szekvenciákban. A véglemezeknek megfelelő szklerotikus elváltozásokat figyeltek meg6. Az MC a gerinc patológiás betegségének számít, és szorosan összefügg a gerinc számos degeneratív betegségével7,8,9.
Figyelembe véve a rendelkezésre álló adatokat, számos tanulmány részletes betekintést nyújtott az MC etiológiájába és patológiai mechanizmusaiba. Albert et al. azt javasolta, hogy az MC-t porckorongsérv okozhatja8. Hu és mtsai. az MC-t súlyos porckorongdegenerációnak tulajdonították10. Kroc javasolta a „belső porckorongszakadás” koncepcióját, amely szerint az ismétlődő porckorongsérülések mikroszakadásokhoz vezethetnek a véglemezben. A hasadék kialakulása után a nucleus pulposus (NP) véglemez-pusztulása autoimmun választ válthat ki, ami tovább vezet az MC11 kialakulásához. Ma et al. hasonló nézetet vallott, és arról számolt be, hogy az NP által kiváltott autoimmunitás kulcsszerepet játszik az MC12 patogenezisében.
Az immunrendszer sejtjei, különösen a CD4+ T helper limfociták kritikus szerepet játszanak az autoimmunitás patogenezisében13. A közelmúltban felfedezett Th17 alcsoport az IL-17 proinflammatorikus citokint termeli, elősegíti a kemokin expresszióját, és a sérült szervekben lévő T-sejteket IFN-y14 termelésére serkenti. A Th2 sejtek egyedülálló szerepet játszanak az immunválaszok patogenezisében is. Az IL-4 mint reprezentatív Th2 sejt expressziója súlyos immunpatológiai következményekhez vezethet15.
Bár számos klinikai vizsgálatot végeztek az MC16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 sejteken, még mindig hiányoznak a megfelelő állatkísérleti modellek, amelyek utánozhatnák az emberekben gyakran előforduló MC folyamatot, és az etiológia vagy az új kezelések, például a célzott terápia vizsgálatára használják. Eddig csak néhány MC állatmodellről számoltak be, amelyek tanulmányozták a mögöttes patológiás mechanizmusokat.
Az Albert és Ma által javasolt autoimmun elmélet alapján ez a tanulmány egy egyszerű és reprodukálható nyúl MC modellt hozott létre úgy, hogy az NP-t a fúrt csigolyavéglemez közelében autotransplantáltuk. További cél az állatmodellek szövettani jellemzőinek megfigyelése és az NP specifikus mechanizmusainak értékelése az MC kialakulásában. Ebből a célból olyan technikákat alkalmazunk, mint a molekuláris biológia, az MRI és a szövettani vizsgálatok az MC progressziójának tanulmányozására.
Két nyúl elpusztult vérzésben a műtét során, négy nyúl pedig az MRI alatti altatás során. A fennmaradó 48 nyúl túlélte, és nem mutattak viselkedési vagy neurológiai tüneteket a műtét után.
Az MRI azt mutatja, hogy a különböző lyukakban lévő beágyazott szövetek jelintenzitása eltérő. Az L5 csigolyatest jelintenzitása az NPE csoportban a behelyezés után 12, 16 és 20 héttel fokozatosan megváltozott (a T1W szekvencia alacsony jelet mutatott, a T2W szekvencia pedig vegyes jelet és alacsony jelet) (1C. ábra), míg az MRI megjelenése a másik két beágyazott részcsoportból viszonylag stabil maradt ugyanebben az időszakban (1A, B ábra).
(A) A nyúl ágyéki gerincének reprezentatív szekvenciális MRI-jei 3 időpontban. Az áloperált csoport felvételein nem találtunk jelrendellenességet. (B) A csigolyatest jeltulajdonságai az ME csoportban hasonlóak az álműtét csoportéhoz, és a beágyazás helyén nem figyelhető meg szignifikáns jelváltozás az idő múlásával. (C) Az NPE csoportban az alacsony jel jól látható a T1W szekvenciában, a vegyes jel és az alacsony jel pedig jól látható a T2W sorozatban. A 12 hetes periódusról a 20 hetes periódusra a T2W szekvenciában az alacsony jeleket körülvevő sporadikus magas jelek csökkennek.
Nyilvánvaló csonthiperplázia látható a csigolyatest beültetési helyén az NPE csoportban, és a csonthiperplázia 12-20 hét között gyorsabban jelentkezik (2C. ábra) az NPE csoporthoz képest, a modellezett csigolyában nem figyelhető meg szignifikáns változás testek; Ál-csoport és ME-csoport (2C. ábra) 2A,B).
(A) A beültetett részen a csigolyatest felszíne nagyon sima, a lyuk jól gyógyul, és nincs hyperplasia a csigolyatestben. (B) A beültetett hely alakja az ME csoportban hasonló az álműtét csoportéhoz, és nincs nyilvánvaló változás a beültetett hely megjelenésében az idő múlásával. (C) Csont hiperplázia fordult elő a beültetett helyen az NPE csoportban. A csonthiperplázia gyorsan növekedett, és a csigolyaközi porckorongon keresztül az ellenoldali csigolyatestig is kiterjedt.
A szövettani elemzés részletesebb információt nyújt a csontképződésről. A 3. ábra a H&E-vel festett posztoperatív metszetek fényképeit mutatja. Az álműtét csoportban a kondrociták jól elrendeződtek, és nem észleltünk sejtproliferációt (3A. ábra). A ME csoportban a helyzet hasonló volt az álműtét csoportéhoz (3B. ábra). Az NPE csoportban azonban nagyszámú kondrocita és NP-szerű sejtek proliferációja volt megfigyelhető az implantációs helyen (3C. ábra);
(A) Trabekulák láthatók a véglemez közelében, a kondrociták szépen elrendezve, egyenletes sejtmérettel és -formával, és nincs proliferáció (40-szer). (B) A beültetési hely állapota az ME-csoportban hasonló az ál-csoportéhoz. Trabekulák és chondrocyták láthatók, de a beültetés helyén nincs nyilvánvaló proliferáció (40-szer). (B) Látható, hogy a chondrocyták és az NP-szerű sejtek szignifikánsan szaporodnak, és a kondrociták alakja és mérete egyenetlen (40-szeres).
Az interleukin 4 (IL-4) mRNS, az interleukin 17 (IL-17) mRNS és az interferon γ (IFN-γ) mRNS expresszióját mind az NPE, mind az ME csoportban megfigyelték. A célgének expressziós szintjének összehasonlításakor az IL-4, IL-17 és IFN-γ génexpressziója szignifikánsan megemelkedett az NPE csoportban az ME csoporthoz és az álműtét csoporthoz képest (4. ábra). (P < 0,05). Az áloperációs csoporthoz képest az IL-4, IL-17 és IFN-γ expressziós szintje az ME csoportban csak kismértékben emelkedett, és nem érte el a statisztikai változást (P > 0,05).
Az IL-4, IL-17 és IFN-γ mRNS expressziója az NPE csoportban szignifikánsan magasabb tendenciát mutatott, mint az álműtétes csoportban és az ME csoportban (P < 0,05).
Ezzel szemben az ME-csoport expressziós szintjei nem mutattak szignifikáns különbséget (P>0,05).
Western blot analízist végeztünk kereskedelmi forgalomban kapható IL-4 és IL-17 elleni antitestek felhasználásával a megváltozott mRNS expressziós mintázat megerősítésére. Amint az 5A., B. ábrákon látható, az ME-csoporttal és az álműtétes csoporttal összehasonlítva az IL-4 és IL-17 fehérjeszintje az NPE-csoportban szignifikánsan megnőtt (P<0,05). Az áloperációs csoporthoz képest az IL-4 és IL-17 fehérjeszintje az ME csoportban sem ért el statisztikailag szignifikáns változást (P> 0,05).
(A) Az IL-4 és IL-17 fehérjeszintje az NPE-csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint az ME-csoportban és a placebo-csoportban (P <0,05). (B) Western blot hisztogram.
A műtét során nyert humán minták korlátozott száma miatt az MC patogenezisének egyértelmű és részletes vizsgálata kissé nehézkes. Megkíséreltük felállítani az MC állatmodelljét, hogy tanulmányozzuk lehetséges kóros mechanizmusait. Ugyanakkor radiológiai, szövettani és molekuláris biológiai értékeléssel követtük az NP autograft által kiváltott MC lefolyását. Ennek eredményeként az NP beültetési modell a jelintenzitás fokozatos változását eredményezte 12 hetesről 20 hetes időpontokra (kevert alacsony jel a T1W szekvenciákban és alacsony jel a T2W szekvenciákban), jelezve a szöveti változásokat, valamint a szövettani és molekuláris változásokat. biológiai értékelések megerősítették a radiológiai vizsgálat eredményeit.
A kísérlet eredményei azt mutatják, hogy az NPE csoportban vizuális és szövettani változások következtek be a csigolyatest-sérülés helyén. Ugyanakkor megfigyelték az IL-4, IL-17 és IFN-γ gének, valamint az IL-4, IL-17 és IFN-γ expresszióját, ami arra utal, hogy az autológ nucleus pulposus szövet megsértése a csigolyában szervezet jel- és morfológiai változások sorozatát okozhatja. Könnyen megállapítható, hogy az állatmodell csigolyatesteinek jeltulajdonságai (alacsony jel a T1W szekvenciában, kevert jel és alacsony jel a T2W szekvenciában) nagyon hasonlóak az emberi csigolyasejtekéhez, és az MRI jellemzői is. megerősítik a szövettani és durva anatómiai megfigyeléseket, vagyis a csigolyatest sejtjeiben bekövetkező változások progresszívek. Bár az akut trauma által okozott gyulladásos válasz hamarosan megjelenhet a szúrás után, az MRI-eredmények azt mutatták, hogy a szúrás után 12 héttel fokozatosan növekvő jelváltozások jelentkeztek, és 20 hétig fennmaradtak a gyógyulás vagy az MRI-változások megfordítása nélkül. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az autológ vertebralis NP megbízható módszer a progresszív MV megállapítására nyulakban.
Ez a punkciós modell megfelelő szakértelmet, időt és sebészeti erőfeszítést igényel. Az előzetes kísérletekben a paravertebralis szalagos struktúrák disszekciója vagy túlzott stimulálása csigolya osteophyták képződését eredményezheti. Ügyeljen arra, hogy ne sértse meg vagy ne irritálja a szomszédos lemezeket. Mivel a behatolás mélységét szabályozni kell a következetes és reprodukálható eredmények eléréséhez, kézzel készítettünk egy dugót egy 3 mm hosszú tű hüvelyének levágásával. Ennek a dugónak a használata egyenletes fúrási mélységet biztosít a csigolyatestben. Az előzetes kísérletek során három, a műtétben részt vevő ortopéd sebész úgy találta, hogy a 16-os tűkkel könnyebb dolgozni, mint a 18-as tűkkel vagy más módszerekkel. A fúrás közbeni túlzott vérzés elkerülése érdekében, ha a tűt egy ideig mozdulatlanul tartja, megfelelőbb beszúrási lyukat biztosít, ami azt sugallja, hogy az MC bizonyos fokát így lehet szabályozni.
Bár sok tanulmány célozta az MC-t, keveset tudunk az MC25, 26, 27 etiológiájáról és patogeneziséről. Korábbi vizsgálataink alapján azt találtuk, hogy az autoimmunitás kulcsszerepet játszik az MC12 előfordulásában és kialakulásában. Ez a tanulmány az IL-4, IL-17 és IFN-γ kvantitatív expresszióját vizsgálta, amelyek a CD4+ sejtek fő differenciálódási útvonalai antigénstimuláció után. Vizsgálatunkban a negatív csoporthoz képest az NPE csoportban magasabb volt az IL-4, IL-17 és IFN-γ expressziója, valamint az IL-4 és IL-17 fehérjeszintje is magasabb volt.
Klinikailag az IL-17 mRNS expressziója megnő a porckorongsérvben szenvedő betegek NP sejtjeiben28. Az egészséges kontrollokhoz képest megnövekedett IL-4 és IFN-γ expressziós szintet is találtak egy akut, nem kompressziós porckorongsérv modellben29. Az IL-17 kulcsszerepet játszik a gyulladásban, az autoimmun betegségek szövetkárosodásában30, és fokozza az IFN-γ31 elleni immunválaszt. Fokozott IL-17 által közvetített szövetkárosodást jelentettek MRL/lpr egerekben32 és autoimmunitásra érzékeny egerekben33. Az IL-4 gátolhatja a proinflammatorikus citokinek (például IL-1β és TNFα) expresszióját és a makrofágok aktivációját34. Beszámoltak arról, hogy az IL-4 mRNS expressziója eltérő volt az NPE-csoportban, mint az IL-17 és az IFN-y azonos időpontban; Az IFN-γ mRNS expressziója az NPE csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint a többi csoportban. Ezért az IFN-γ termelés közvetítője lehet az NP interkalációja által kiváltott gyulladásos válasznak. A vizsgálatok kimutatták, hogy az IFN-γ-t többféle sejttípus termeli, beleértve az aktivált 1-es típusú helper T-sejteket, a természetes ölősejteket és a makrofágokat35,36, és kulcsfontosságú gyulladást elősegítő citokin, amely elősegíti az immunválaszokat37.
Ez a tanulmány arra utal, hogy az autoimmun válasz szerepet játszhat az MC előfordulásában és kialakulásában. Luoma et al. azt találta, hogy az MC és a kiemelkedő NP jel jellemzői hasonlóak az MRI-n, és mindkettő magas jelet mutat a T2W szekvenciában38. Egyes citokinekről bebizonyosodott, hogy szoros kapcsolatban állnak az MC előfordulásával, mint például az IL-139. Ma et al. azt sugallta, hogy az NP felfelé vagy lefelé történő kiemelkedése nagy hatással lehet az MC12 előfordulására és fejlődésére. Bobechko40 és Herzbein és munkatársai41 arról számoltak be, hogy az NP egy immuntoleráns szövet, amely születésétől fogva nem tud bejutni a vaszkuláris keringésbe. Az NP nyúlványok idegen testeket juttatnak be a vérellátásba, ezáltal helyi autoimmun reakciókat közvetítenek42. Az autoimmun reakciók számos immunfaktort indukálhatnak, és ha ezek a faktorok folyamatosan érintkeznek a szövetekkel, változásokat okozhatnak a jelátvitelben43. Ebben a vizsgálatban az IL-4, IL-17 és IFN-γ túlzott expressziója tipikus immuntényezők, ami tovább bizonyítja az NP és az MCs44 közötti szoros kapcsolatot. Ez az állatmodell jól utánozza az NP áttörést és a véglemezbe való bejutást. Ez a folyamat tovább tárta fel az autoimmunitás hatását az MC-re.
Ahogy az várható volt, ez az állatmodell lehetséges platformot biztosít számunkra az MC tanulmányozására. Ennek a modellnek azonban még vannak korlátai: először is, az állatmegfigyelési szakaszban egyes köztes stádiumú nyulakat szövettani és molekuláris biológiai vizsgálatok céljából el kell végezni, így egyes állatok idővel „kiesnek a használatból”. Másodszor, bár ebben a tanulmányban három időpont van beállítva, sajnos csak egy típusú MC-t modelleztünk (Modic I. típusú változás), így nem elegendő az emberi betegségek kialakulásának folyamatát ábrázolni, hanem több időpontot kell beállítani jobban figyelje az összes jelváltozást. Harmadszor, a szövetszerkezet változásai valóban egyértelműen kimutathatók szövettani festéssel, de egyes speciális technikák jobban feltárják a mikroszerkezeti változásokat ebben a modellben. Például polarizált fénymikroszkópiával elemezték a rostos porc képződését nyúl intervertebralis lemezeiben45. Az NP hosszú távú hatásai az MC-re és a véglemezre további vizsgálatokat igényelnek.
Ötvennégy hím új-zélandi fehér nyulat (körülbelül 2,5-3 kg súlyú, 3-3,5 hónapos korú) véletlenszerűen osztottunk színlelt műtéti csoportra, izombeültetési csoportra (ME-csoport) és ideggyök-beültetési csoportra (NPE-csoport). Minden kísérleti eljárást jóváhagyott a Tiencsin Kórház Etikai Bizottsága, és a kísérleti módszereket szigorúan a jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtották végre.
Néhány fejlesztés történt S. Sobajima 46 műtéti technikáján. Mindegyik nyulat oldalsó fekvő helyzetbe helyeztük, és az öt egymást követő lumbalis intervertebrális lemez (IVD) elülső felületét posterolaterális retroperitoneális megközelítéssel exponáltuk. Mindegyik nyulat általános érzéstelenítésben részesítettük (20% uretán, 5 ml/kg a fülvénán keresztül). A bordák alsó szélétől a medence pereméig hosszirányú bőrmetszést végeztünk, 2 cm-rel a paravertebralis izmok ventrálisan. Az L1-től L6-ig terjedő jobb oldali anterolaterális gerincet a fedő bőr alatti szövet, a retroperitoneális szövet és az izmok éles és tompa kimetszésével szabadítottuk fel (6A. ábra). A porckorong szintjét a medence peremének mint anatómiai mérföldkőnek a segítségével határoztuk meg az L5-L6 lemezszinthez. 16-os átszúró tűvel fúrjon egy lyukat az L5 csigolya véglemeze közelében 3 mm mélységig (6B. ábra). 5 ml-es fecskendővel szívja fel az autológ nucleus pulposust az L1-L2 csigolyaközi porckorongban (6C. ábra). Távolítsa el a nucleus pulposust vagy izmot az egyes csoportok igényei szerint. A fúrólyuk mélyítése után felszívódó varratokat helyezünk a mély fasciára, a felületes fasciára és a bőrre, ügyelve arra, hogy a műtét során a csigolyatest csonthártya szövete ne sérüljön.
(A) Az L5–L6 lemezt posterolaterális retroperitoneális megközelítéssel szabadítják fel. (B) 16-os tűvel fúrjon lyukat az L5 véglemez közelében. (C) Az autológ MF-eket begyűjtik.
Az általános érzéstelenítést 20%-os uretánnal (5 ml/ttkg) adtuk be a fülvénán keresztül, és az ágyéki gerinc röntgenfelvételét a műtét utáni 12., 16. és 20. héten megismételtük.
A nyulakat ketamin (25,0 mg/kg) és intravénás nátrium-pentobarbitál (1,2 g/kg) intramuszkuláris injekciójával leöltük a műtét után 12, 16 és 20 héttel. A teljes gerincet szövettani elemzés céljából eltávolítottuk, és valódi elemzést végeztünk. Az immunfaktorok változásainak kimutatására kvantitatív reverz transzkripciót (RT-qPCR) és Western blottingot használtunk.
Az MRI-vizsgálatokat nyulakon 3,0 T-s klinikai mágnessel (GE Medical Systems, Firenze, SC) végeztük, amely ortogonális végtagi tekercs vevővel volt felszerelve. A nyulakat 20%-os uretánnal (5 ml/kg) érzéstelenítettük a fülvénán keresztül, majd hanyatt fektettük a mágnesben úgy, hogy az ágyéki régió egy 5 hüvelyk átmérőjű körkörös felületi tekercsen volt középen (GE Medical Systems). Koronális T2 súlyozott lokalizáló képeket (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) készítettünk az ágyéki porckorong helyének meghatározásához L3–L4 és L5–L6 között. A szagittális síkú T2 súlyozott szeleteket a következő beállításokkal vettük fel: gyors spin-echo szekvencia 2200 ms ismétlési idővel (TR) és 70 ms visszhangidővel (TE), mátrix; 260 látómező és nyolc inger; A vágási vastagság 2 mm, a rés 0,2 mm volt.
Az utolsó fénykép elkészítése és az utolsó nyúl leölése után az ál-, izombeágyazott és NP-lemezeket szövettani vizsgálat céljából eltávolítottuk. A szöveteket 10%-os semleges pufferolt formalinban fixáltuk 1 hétig, etilén-diamin-tetraecetsavval vízkőtelenítettük, és paraffin metszeteket készítettünk. A szövetblokkokat paraffinba ágyaztuk, és mikrotom segítségével sagittalis metszetekre vágtuk (5 μm vastagságban). A metszeteket hematoxilinnel és eozinnal (H&E) festettük.
Miután minden csoportban összegyűjtöttük a csigolyaközi lemezeket a nyulakról, a teljes RNS-t UNIQ-10 oszlopon (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Kína) extraháltuk a gyártó utasításai szerint, és egy ImProm II reverz transzkripciós rendszerrel (Promega Inc. , Madison, WI, USA). Reverz transzkripciót végeztünk.
Az RT-qPCR-t Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) és SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) segítségével hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint. A PCR reakciótérfogata 20 μl volt, és 1,5 μl hígított cDNS-t és 0,2 μM primert tartalmazott. Az alapozókat az OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) tervezte, és a Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Kína) gyártotta (1. táblázat). A következő termikus ciklusos körülményeket alkalmaztuk: kezdeti polimeráz aktiválási lépés 94 °C-on 2 percig, majd 40 ciklus 15 másodpercenként 94 °C-on a templát denaturálásához, 1 perces hőkezelés 60 °C-on, meghosszabbítás és fluoreszcencia. a méréseket 1 percig 72°C-on végeztük. Minden mintát háromszor amplifikáltunk, és az átlagértéket használtuk az RT-qPCR analízishez. Az amplifikációs adatokat FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) segítségével elemeztük. Az IL-4, IL-17 és IFN-y gén expresszióját az endogén kontrollhoz (ACTB) normalizáltuk. A cél-mRNS relatív expressziós szintjét a 2-ΔΔCT módszerrel számítottuk ki.
A teljes fehérjét a szövetekből szövethomogenizátorral extraháltuk RIPA lízispufferben (amely proteáz és foszfatáz inhibitor koktélt tartalmaz), majd 13 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 20 percig 4 °C-on, hogy eltávolítsuk a szövettörmeléket. Ötven mikrogramm fehérjét töltöttünk fel sávonként, 10%-os SDS-PAGE-val elválasztottuk, majd PVDF membránra vittük át. A blokkolást 0,1% Tween 20-at tartalmazó 5%-os zsírmentes száraz tejben, 0,1% Tween 20-at tartalmazó Tris-puffered sóoldatban (TBS) hajtottuk végre 1 órán át szobahőmérsékleten. A membránt nyúl anti-decorin primer antitesttel (1:200 hígítás; Boster, Wuhan, Kína) (1:200 hígítás; Bioss, Peking, Kína) inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on, majd a második napon reagáltattuk; másodlagos antitesttel (kecske anti-nyúl immunglobulin G 1:40 000 hígításban) torma-peroxidázzal kombinálva (Boster, Wuhan, Kína) 1 órán át szobahőmérsékleten. A Western blot jeleket a kemilumineszcens membrán megnövekedett kemilumineszcenciájával detektáltuk röntgen besugárzás után. A denzitometriás analízishez a blotokat a BandScan szoftverrel szkenneltük és mennyiségileg meghatároztuk, és az eredményeket a célgén immunreaktivitás és a tubulin immunreaktivitás arányaként fejeztük ki.
A statisztikai számításokat az SPSS16.0 szoftvercsomag (SPSS, USA) segítségével végeztük. A vizsgálat során összegyűjtött adatokat átlag ± standard deviáció (átlag ± SD) formában fejeztük ki, és egyutas ismételt mérési varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük a két csoport közötti különbségek meghatározására. P < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekinthető.
Így az MC állatmodelljének létrehozása autológ NP-k csigolyatestbe történő beültetésével és makroanatómiai megfigyeléssel, MRI-analízissel, szövettani kiértékeléssel és molekuláris biológiai elemzéssel fontos eszközzé válhat az emberi MC mechanizmusainak felmérésében és megértésében, valamint új terápiás terápiás fejlesztésekben. beavatkozások.
Hogyan idézzük ezt a cikket: Han, C. et al. A Modic elváltozások állatmodelljét autológ nucleus pulposus beültetésével hozták létre az ágyéki gerinc subchondralis csontjába. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. és Boos, N. Az ágyéki gerinc mágneses rezonancia képalkotása: a porckorongsérv és -retenció prevalenciája, az ideggyökér-kompresszió, a véglemez rendellenességek és a fazett ízületi osteoarthritis tünetmentes önkénteseknél . arány. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS és Leboeuf-Eed, K. Modic változások és kapcsolatuk a klinikai eredményekkel. European Spine Journal: az European Spine Society, a European Society of Spinal Deformity és a European Society for Cervical Spine Research hivatalos kiadványa 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. és mtsai. Módosult változások az ágyéki csigolya véglemezeiben: prevalencia és összefüggés a deréktáji fájdalommal és az isiászszal középkorú férfi munkavállalókban. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. és Dalinka, M. MRI a csontvelő változásairól a véglemez közelében az ágyéki gerinc degeneratív betegségében. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ és Carter, JR. Degeneratív lemezbetegség: a csigolyavelő-elváltozások értékelése MRI-vel. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS és Carter, JR. Degeneratív lemezbetegség képalkotása. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS és mtsai. A neovertebralis véglemez (Modic) prediktorai változást jeleznek az általános populációban. European Spine Journal: Az Európai Gerincdeformációs Társaság, az Európai Gerincdeformitási Társaság és az Európai Nyaki Gerinc-kutató Társaság hivatalos kiadványa, 19. osztály, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB és Mannisch, K. Modic változások az ágyéki porckorongsérv után. European Spine Journal : Az Európai Gerincdeformációs Társaság, a Gerincdeformitás Európai Társasága és az Európai Nyaki Gerinckutató Társaság hivatalos kiadványa 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. A Modic I-es típusú változások előre jelezhetik a gyorsan progresszív deformációs lemez degenerációt: 1 éves prospektív tanulmány. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ és Fan, SW Módosított változások: lehetséges okok és hozzájárulás az ágyéki porckorong degenerációjához. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Belső lemezszakadás. Porckorongsüllyedés-problémák 50 év felett. Spine (Phila Pa 1976), 11, 650–653 (1986).


Feladás időpontja: 2024. december 13