Köszönjük, hogy felkereste a nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében a legújabb böngészőverzió használatát javasoljuk (vagy a kompatibilitási mód letiltását az Internet Explorerben). Ezenkívül a folyamatos támogatás biztosítása érdekében ez az oldal mentes lesz a stílusoktól és a JavaScripttől.
A vázizomzat egy heterogén szövet, amely túlnyomórészt miofibrillákból áll, amelyeket emberben jellemzően három típusba sorolnak: egy „lassú” (1-es típus) és két „gyors” (2A és 2X típus). A hagyományos miofibrill típusok közötti és azokon belüli heterogenitás azonban még mindig kevéssé ismert. Transzkriptomikai és proteomikai megközelítéseket alkalmaztunk 1050, illetve 1038 egyedi miofibrillán az emberi vastus lateralisból. A proteomikai vizsgálatba férfiak, a transzkriptomikai vizsgálatba pedig 10 férfi és 2 nő vett részt. A miozin nehézlánc izoformái mellett metabolikus fehérjéket, riboszomális fehérjéket és sejtes junkciós fehérjéket is azonosítottunk a többdimenziós intermiofibrill variabilitás forrásaként. Továbbá, a lassú és gyors rostok klasztereinek azonosítása ellenére adataink arra utalnak, hogy a 2X típusú rostok fenotípusosan megkülönböztethetetlenek a többi gyors összehúzódású rosttól. Továbbá a miozin nehézlánc alapú osztályozás nem elegendő a miofibrill fenotípus leírására nemalin myopathiákban. Összességében adataink többdimenziós miofoster heterogenitásra utalnak, ahol a variációs források túlmutatnak a miozin nehézlánc izoformáin.
A sejtek heterogenitása minden biológiai rendszer inherens tulajdonsága, lehetővé téve a sejtek specializálódását a szövetek és sejtek különböző igényeinek kielégítésére.1 A vázizomrostok heterogenitásának hagyományos nézete az volt, hogy a motoros neuronok határozzák meg a rosttípust egy motoros egységen belül, és hogy a rosttípust (azaz az 1-es, 2A és 2X típusú emberekben) a miozin nehézlánc (MYH) izoformáinak jellemzői határozzák meg.2 Ez kezdetben a pH-ATPáz instabilitásukon alapult,3,4 később pedig a MYH molekuláris expresszióján.5 Azonban a „vegyes” rostok azonosításával és későbbi elfogadásával, amelyek több MYH-t expresszálnak különböző arányokban, a vázizomrostokat egyre inkább folytonosságnak tekintik, nem pedig különálló rosttípusoknak.6 Ennek ellenére a terület továbbra is nagymértékben a MYH-ra támaszkodik, mint az miorostok osztályozásának elsődleges osztályozójára, ezt a nézetet valószínűleg a korai rágcsálóvizsgálatok korlátai és jelentős torzításai befolyásolják, amelyek MYH expressziós profiljai és rosttípusainak skálája eltér az emberekétől.2 A helyzetet tovább bonyolítja az a tény, hogy a különböző emberi vázizmok a rosttípusok sokféleségét mutatják.7 A vastus lateralis egy vegyes izom egy köztes (és így reprezentatív) MYH expressziós profillal.7 Továbbá, a mintavételezés egyszerűsége teszi az emberi izomszövet legjobban tanulmányozott formájává.
Így a vázizomrostok sokféleségének elfogulatlan vizsgálata hatékony „omika” eszközökkel kritikus, de egyben kihívást is jelent, részben a vázizomrostok többmagvú jellege miatt. Azonban a transzkriptomika8,9 és a proteomika10 technológiák érzékenysége forradalmasodott az elmúlt években a különféle technológiai fejlesztéseknek köszönhetően, lehetővé téve a vázizomzat egyszálú felbontásban történő elemzését. Ennek eredményeként jelentős előrelépés történt az egyszálú diverzitás jellemzésében, valamint az atrófiás ingerekre és az öregedésre adott válaszukban11,12,13,14,15,16,17,18. Fontos, hogy ezek a technológiai fejlesztések klinikai alkalmazásokkal is rendelkeznek, lehetővé téve a betegséggel összefüggő szabályozási zavarok részletesebb és pontosabb jellemzését. Például a nemalin miopátia, az egyik leggyakoribb öröklött izombetegség (MIM 605355 és MIM 161800) patofiziológiája összetett és zavaros.19,20 Ezért a vázizomrostok szabályozási zavarának jobb jellemzése jelentős előrelépést eredményezhet a betegség megértésében.
Módszereket fejlesztettünk ki emberi biopsziás mintákból manuálisan izolált egyedi vázizomrostok transzkriptomikai és proteomikai elemzésére, és ezeket több ezer rostra alkalmaztuk, lehetővé téve számunkra az emberi vázizomrostok sejtes heterogenitásának vizsgálatát. Munkánk során bemutattuk az izomrostok transzkriptomikai és proteomikai fenotipizálásának erejét, és azonosítottuk a metabolikus, riboszomális és sejtes junkciós fehérjéket, mint a rostok közötti variabilitás jelentős forrásait. Továbbá, ezt a proteomikai munkafolyamatot alkalmazva jellemeztük a fonálféreg-miopátia klinikai jelentőségét az egyedi vázizomrostokban, feltárva a nem-oxidatív rostok felé történő koordinált eltolódást, függetlenül a rosttípustól a MYH alapján.
Az emberi vázizomrostok heterogenitásának vizsgálatához két munkafolyamatot fejlesztettünk ki, amelyek lehetővé teszik az egyes vázizomrostok transzkriptom- és proteomelemzését (1A. ábra és 1A. kiegészítő ábra). Számos módszertani lépést fejlesztettünk ki és optimalizáltunk, a minták tárolásától és az RNS- és fehérjeintegritás megőrzésétől az egyes megközelítések áteresztőképességének optimalizálásáig. A transzkriptomelemzéshez ezt úgy értük el, hogy a reverz transzkripció kezdeti lépésében minta-specifikus molekuláris vonalkódokat illesztettünk be, lehetővé téve 96 rost összevonását a hatékony downstream feldolgozáshoz. A hagyományos egysejtes megközelítésekhez képest mélyebb szekvenálás (±1 millió leolvasás rostonként) tovább gazdagította a transzkriptom adatokat.21 A proteomika esetében rövid kromatográfiás gradienst (21 perc) alkalmaztunk DIA-PASEF adatgyűjtéssel kombinálva egy timsTOF tömegspektrométeren, hogy optimalizáljuk a proteommélységet, miközben fenntartjuk a magas áteresztőképességet.22,23 Az egészséges vázizomrostok heterogenitásának vizsgálatához 14 egészséges felnőtt donortól származó 1050 egyedi rost transzkriptomját és 5 egészséges felnőtt donortól származó 1038 rost proteomját jellemeztük (1. kiegészítő táblázat). Ebben a tanulmányban ezeket az adathalmazokat 1000 rostból álló transzkriptomáknak és proteomáknak nevezzük. Megközelítésünk összesen 27 237 transzkriptumot és 2983 fehérjét detektált az 1000 rostból álló transzkriptomikai és proteomikai elemzésekben (1A. ábra, 1–2. kiegészítő adathalmazok). Miután a transzkriptomikai és proteomikai adathalmazokat >1000 detektált génre és rostonként 50%-ban érvényes értékekre szűrtük, további bioinformatikai elemzéseket végeztünk a transzkriptom 925, illetve a proteom 974 rostján. A szűrés után átlagosan 4257 ± 1557 gént és 2015 ± 234 fehérjét (átlag ± SD) detektáltunk rostonként, korlátozott egyének közötti variabilitással (1B–C. kiegészítő ábrák, 3–4. kiegészítő adathalmazok). Az egyéneken belüli variabilitás azonban kifejezettebb volt a résztvevők között, valószínűleg a különböző hosszúságú és keresztmetszeti területű rostok közötti RNS/fehérje-hozambeli különbségek miatt. A legtöbb fehérje (>2000) esetében a variációs koefficiens 20% alatt volt (1D. kiegészítő ábra). Mindkét módszer lehetővé tette a transzkriptumok és az izom-összehúzódáshoz fontos, magas expressziójú szignatúrákkal rendelkező fehérjék széles dinamikus tartományának rögzítését (pl. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (1E–F. kiegészítő ábrák). A legtöbb azonosított jellemző közös volt a transzkriptomikai és a proteomikai adatkészletekben (1G. kiegészítő ábra), és ezen jellemzők átlagos UMI/LFQ intenzitásai meglehetősen jól korreláltak (r = 0,52) (1H. kiegészítő ábra).
Transzkriptomikai és proteomikai munkafolyamat (a BioRender.com segítségével létrehozva). BD Dinamikus tartomány görbék az MYH7, MYH2 és MYH1 esetében, valamint számított küszöbértékek a rosttípus-hozzárendeléshez. E, F Az MYH expresszió eloszlása a rostok között transzkriptomikai és proteomikai adatkészletekben. G, H Egyenletes diverzitás közelítés és vetítés (UMAP) diagramok transzkriptomikai és proteomikai adatokhoz, MYH-alapú rosttípus szerint színezve. I, J Jellemződiagramok, amelyek az MYH7, MYH2 és MYH1 expresszióját mutatják transzkriptomikai és proteomikai adatkészletekben.
Kezdetben azzal a céllal indultunk ki, hogy minden egyes szálhoz MYH-alapú rosttípust rendeljünk egy optimalizált megközelítés segítségével, amely kihasználja az MYH expressziójának nagy érzékenységét és dinamikus tartományát az omika adatkészletekben. Korábbi tanulmányok tetszőleges küszöbértékeket használtak a rostok tiszta 1-es, 2A-s, 2X-es vagy kevert típusként való címkézésére a különböző MYH-k expressziójának rögzített százaléka alapján11,14,24. Mi egy másik megközelítést alkalmaztunk, amelyben az egyes rostok expresszióját a rostok tipizálásához használt MYH-k alapján rangsoroltuk: MYH7, MYH2 és MYH1, amelyek az 1-es, 2A-s és 2X-es típusú rostoknak felelnek meg. Ezután matematikailag kiszámítottuk az egyes kapott görbék alsó inflexiós pontját, és küszöbértékként használtuk a rostok pozitív (a küszöbérték felett) vagy negatív (a küszöbérték alatt) besorolásához minden MYH esetében (1B–D. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a MYH7 (1B. ábra) és a MYH2 (1C. ábra) RNS-szinten jobban elkülönülő be/ki expressziós profillal rendelkezik a fehérjeszinthez képest. Valóban, fehérje szinten nagyon kevés rost nem expresszálta a MYH7-et, és egyetlen rost sem expresszálta a MYH2-t 100%-ban. Ezután előre meghatározott expressziós küszöbértékeket használtunk, hogy az egyes adatkészletekben lévő összes rosthoz MYH-alapú rosttípusokat rendeljünk. Például a MYH7+/MYH2-/MYH1- rostokat az 1-es típushoz, míg a MYH7-/MYH2+/MYH1+ rostokat a vegyes 2A/2X típushoz rendeltük (a teljes leírást lásd a 2. kiegészítő táblázatban). Az összes rostot összevonva a MYH-alapú rosttípusok figyelemre méltóan hasonló eloszlását figyeltük meg mind RNS (1E. ábra), mind fehérje (1F. ábra) szinten, míg a MYH-alapú rosttípusok relatív összetétele a várakozásoknak megfelelően egyének között változott (2A. kiegészítő ábra). A legtöbb rostot vagy tiszta 1-es típusként (34–35%), vagy 2A típusként (36–38%) osztályoztuk, bár jelentős számú vegyes 2A/2X típusú rostot is detektáltunk (16–19%). Feltűnő különbség, hogy a tiszta 2X típusú rostok csak RNS-szinten voltak kimutathatók, fehérjeszinten nem, ami arra utal, hogy a gyors MYH expresszió legalább részben poszttranszkripciósan szabályozott.
A proteomikai alapú MYH rosttípus-meghatározási módszerünket antitest-alapú dot blot analízissel validáltuk, és mindkét módszer 100%-os egyezést ért el a tiszta 1-es és 2A típusú rostok azonosításában (lásd a 2B. kiegészítő ábrát). A proteomikai alapú megközelítés azonban érzékenyebbnek és hatékonyabbnak bizonyult a kevert rostok azonosításában, valamint az egyes rostokban található MYH gének arányának számszerűsítésében. Ezek az adatok igazolják az objektív, nagy érzékenységű, omika alapú megközelítés hatékonyságát a vázizomrost-típusok jellemzésére.
Ezután a transzkriptomika és a proteomika által szolgáltatott kombinált információkat felhasználva objektíven osztályoztuk az izomrostokat a teljes transzkriptomjuk vagy proteomjuk alapján. Az egyenletes sokaságú közelítés és projekció (UMAP) módszerrel a dimenzionalitást hat fő komponensre redukáltuk (3A–B kiegészítő ábrák), így vizualizálni tudtuk az izomrostok variabilitását a transzkriptomban (1G. ábra) és a proteomban (1H. ábra). Figyelemre méltó, hogy az izomrostokat sem a transzkriptomikai, sem a proteomikai adatkészletekben nem csoportosítottuk résztvevők (3C–D kiegészítő ábrák), sem tesztelési napok (3E kiegészítő ábra) szerint, ami arra utal, hogy a vázizomrostok egyéneken belüli variabilitása magasabb, mint az egyének közötti variabilitás. Az UMAP diagramon két különálló klaszter jelent meg, amelyek a „gyors” és a „lassú” izomrostokat képviselik (1G–H ábrák). A MYH7+ (lassú) miorostok az UMAP1 pozitív pólusánál, míg a MYH2+ és MYH1+ (gyors) miorostok az UMAP1 negatív pólusánál csoportosultak (1I–J. ábra). Azonban a gyors összehúzódású rosttípusok (azaz 2A típus, 2X típus vagy kevert 2A/2X) között nem tettek különbséget a MYH expresszió alapján, ami arra utal, hogy a MYH1 (1I–J. ábra) vagy más klasszikus 2X miorost markerek, mint például az ACTN3 vagy a MYLK2 (4A–B. kiegészítő ábrák) expressziója nem tesz különbséget a különböző miorost típusok között a teljes transzkriptom vagy proteom tekintetében. Ezenkívül a MYH2-höz és MYH7-hez képest kevés transzkriptum vagy fehérje korrelált pozitívan a MYH1-gyel (4C–H. kiegészítő ábrák), ami arra utal, hogy a MYH1 mennyisége nem tükrözi teljes mértékben a miorost transzkriptomot/proteomot. Hasonló következtetésekre jutottak a három MYH izoforma vegyes expressziójának UMAP szintű vizsgálatakor (4I–J. kiegészítő ábrák). Így, míg a 2X rostok transzkriptumszinten azonosíthatók pusztán a MYH kvantifikációja alapján, a MYH1+ rostok nem különböztethetők meg más gyors rostoktól, ha a teljes transzkriptomot vagy proteomot vizsgáljuk.
A lassú rostok MYH-n túli heterogenitásának kezdeti vizsgálataként négy, már bevált, lassú rosttípus-specifikus fehérjét vizsgáltunk: a TPM3-at, a TNNT1-et, a MYL3-at és az ATP2A22-t. A lassú rost altípusok magas, bár nem tökéletes Pearson-korrelációt mutattak a MYH7-tel mind a transzkriptomikában (5A. kiegészítő ábra), mind a proteomikában (5B. kiegészítő ábra). A lassú rostok körülbelül 25%-át, illetve 33%-át nem osztályozták tisztán lassú rostként minden gén/fehérje altípus szerint a transzkriptomikában (5C. kiegészítő ábra), illetve a proteomikában (5D. kiegészítő ábra). Ezért a több gén/fehérje altípuson alapuló lassú rost-osztályozás további bonyolultságot okoz, még azoknál a fehérjéknél is, amelyekről ismert, hogy rosttípus-specifikusak. Ez arra utal, hogy egyetlen gén/fehérje család izoformáion alapuló rost-osztályozás nem feltétlenül tükrözi megfelelően a vázizomrostok valódi heterogenitását.
Az emberi vázizomrostok fenotípusos variabilitásának a teljes omika modell skáláján történő további vizsgálata érdekében elfogulatlan dimenziócsökkentést végeztünk az adatokon főkomponens-analízis (PCA) segítségével (2A. ábra). Az UMAP-diagramokhoz hasonlóan sem a résztvevő, sem a tesztelési nap nem befolyásolta a rostcsoportosulást a PCA szintjén (6A–C. kiegészítő ábrák). Mindkét adatkészletben a MYH-alapú rosttípust a PC2 magyarázta, amely egy lassú összehúzódású 1-es típusú rostok klaszterét, valamint egy második klasztert mutatott, amely gyors összehúzódású 2A típusú, 2X típusú és vegyes 2A/2X rostokat tartalmazott (2A. ábra). Mindkét adatkészletben ezt a két klasztert kis számú vegyes 1/2A típusú rost kötötte össze. A várakozásoknak megfelelően a fő PC-vezérlők túlreprezentáció-elemzése megerősítette, hogy a PC2-t kontraktilis és metabolikus jellemzők vezérelték (2B. ábra és 6D–E. kiegészítő ábrák, 5–6. kiegészítő adatkészletek). Összességében a MYH-alapú rosttípus elegendőnek bizonyult a PC2 mentén zajló folyamatos variáció magyarázatához, kivéve az úgynevezett 2X rostokat, amelyek a gyors klaszteren belül a transzkriptomban oszlanak el.
A. A transzkriptom és proteom adatkészletek főkomponens-analízis (PCA) diagramjai, a MYH alapján rosttípus szerint színezve. B. A PC2 és PC1 transzkriptum- és fehérje-drivereinek dúsulási analízise. A statisztikai elemzést a clusterProfiler csomaggal és Benjamini-Hochberg által korrigált p-értékekkel végeztük. C, D. A transzkriptomban az intercelluláris adhéziós gén ontológia (GO) kifejezések, a proteomban pedig a kostaméra GO kifejezések szerint színezett PCA diagramok. A nyilak a transzkriptum- és fehérje-drivereket és azok irányát jelölik. E, F. Klinikailag releváns jellemzők egyenletes sokaság-approximációs és projekciós (UMAP) diagramjai, amelyek a lassú/gyors rosttípustól független expressziós gradienseket mutatnak. G, H. Korrelációk a PC2 és PC1 driverek között transzkriptomákban és proteómákban.
Váratlan módon a MYH-alapú miorobarb típus csak a második legmagasabb variabilitási fokot (PC2) magyarázta, ami arra utal, hogy a MYH-alapú miorobarb típushoz (PC1) nem kapcsolódó egyéb biológiai tényezők fontos szerepet játszanak a vázizomrostok heterogenitásának szabályozásában. A PC1 főbb mozgatórugóinak túlreprezentáltsági elemzése kimutatta, hogy a PC1 variabilitást elsősorban a transzkriptom sejt-sejt adhéziója és riboszóma-tartalma, valamint a proteom kostamerái és riboszomális fehérjéi határozták meg (2B. ábra és 6D–E. kiegészítő ábrák, 7. kiegészítő adatkészlet). A vázizomban a kostamerák kötik össze a Z-korongot a szarkolemmával, és részt vesznek az erőátvitelben és a jelátvitelben. 25 A sejt-sejt adhéziós (transzkriptom, 2C. ábra) és kostamer (proteom, 2D. ábra) jellemzőket használó annotált PCA-diagramok erős balra eltolódást mutattak a PC1-ben, ami arra utal, hogy ezek a jellemzők bizonyos rostokban gazdagabbak.
Az izomrostok UMAP szintű klasztereződésének részletesebb vizsgálata kimutatta, hogy a legtöbb jellemző az izomrost típusától független, MYH-alapú expressziós gradienst mutatta, nem pedig az izomrost alklaszter-specifikusat. Ezt a folytonosságot számos, patológiás állapotokkal összefüggő gén esetében megfigyelték (2E. ábra), mint például a CHCHD10 (neuromuszkuláris betegség), SLIT3 (izomsorvadás), CTDNEP1 (izombetegség). Ez a folytonosság a proteomban is megfigyelhető volt, beleértve a neurológiai rendellenességekkel (UGDH), az inzulinjelátvitellel (PHIP) és a transzkripcióval (HIST1H2AB) összefüggő fehérjéket (2F. ábra). Ezek az adatok együttesen a rosttípustól független lassú/gyors összehúzódási heterogenitás folytonosságát jelzik a különböző izomrostok között.
Érdekes módon a PC2 driver génjei jó transzkriptom-proteom korrelációt mutattak (r = 0,663) (2G. ábra), ami arra utal, hogy a lassú és gyors összehúzódású rosttípusok, és különösen a vázizomrostok összehúzódási és metabolikus tulajdonságai, transzkripciósan szabályozottak. A PC1 driver génjei azonban nem mutattak transzkriptom-proteom korrelációt (r = -0,027) (2H. ábra), ami arra utal, hogy a lassú/gyors összehúzódású rosttípusoktól független variációk nagyrészt poszttranszkripciósan szabályozottak. Mivel a PC1 variációit elsősorban a riboszomális gén ontológiai kifejezésekkel magyarázták, és mivel a riboszómák kulcsfontosságú és specializált szerepet játszanak a sejtben azáltal, hogy aktívan részt vesznek a fehérjetranszlációban és befolyásolja azt,31 ezután ezt a váratlan riboszomális heterogenitást vizsgáltuk.
Először a proteomikai főkomponens-elemzési diagramot a GOCC „citoplazmatikus riboszóma” kifejezésében található fehérjék relatív abundanciája szerint színeztük ki (3A. ábra). Bár ez a kifejezés a PC1 pozitív oldalán dúsult fel, ami kis gradienst eredményez, a riboszomális fehérjék a PC1 mindkét irányában a particionálást hajtják végre (3A. ábra). A PC1 negatív oldalán dúsult riboszomális fehérjék közé tartozott az RPL18, az RPS18 és az RPS13 (3B. ábra), míg az RPL31, az RPL35 és az RPL38 (3C. ábra) voltak a PC1 pozitív oldalán a fő mozgatórugók. Érdekes módon az RPL38 és az RPS13 a vázizomzatban más szövetekhez képest magas expressziót mutatott (7A. kiegészítő ábra). A PC1-ben található ezeket a jellegzetes riboszomális jellegzetességeket nem figyelték meg a transzkriptomban (7B. kiegészítő ábra), ami a transzkripció utáni szabályozásra utal.
A. A főkomponens-analízis (PCA) diagramja, a proteomon keresztül a citoplazmatikus riboszomális gén ontológia (GO) kifejezések szerint színezve. A nyilak a fehérje-közvetített variáció irányát jelzik a PCA diagramon. A vonalhossz az adott fehérje főkomponens-pontszámának felel meg. B, C. PCA jellemződiagramok az RPS13 és RPL38 esetében. D. Citoplazmatikus riboszomális fehérjék felügyelet nélküli hierarchikus klaszterezési analízise. E. A 80S riboszóma szerkezeti modellje (PDB: 4V6X), amely kiemeli a vázizomrostokban eltérő gyakoriságú riboszomális fehérjéket. F. Különböző sztöchiometriájú riboszomális fehérjék, amelyek az mRNS kilépési csatornája közelében lokalizálódnak.
A riboszomális heterogenitás és specializáció koncepcióját korábban már felvetették, miszerint a különálló riboszóma alpopulációk (riboszómális heterogenitás) jelenléte közvetlenül befolyásolhatja a fehérje transzlációját különböző szövetekben32 és sejtekben33 specifikus mRNS transzkriptumkészletek34 szelektív transzlációján keresztül (riboszóma specializáció). A vázizomrostokban koexpresszált riboszomális fehérjék alpopulációinak azonosítása érdekében felügyelet nélküli hierarchikus klaszteranalízist végeztünk a proteomban található riboszomális fehérjéken (3D. ábra, 8. kiegészítő adatkészlet). A várakozásoknak megfelelően a riboszomális fehérjék nem csoportosultak rosttípus szerint a MYH alapján. Azonban három különálló riboszomális fehérjeklasztert azonosítottunk; az első klaszter (riboszómális_klaszter_1) az RPL38-cal koreregulált, ezért fokozott expressziója van a pozitív PC1 profilú rostokban. A második klaszter (riboszómális_klaszter_2) az RPS13-mal koreregulált, és emelkedett az expressziója a negatív PC1 profilú rostokban. A harmadik klaszter (riboszómális_klaszter_3) nem mutat koordinált differenciális expressziót a vázizomrostokban, és a vázizom „mag” riboszomális fehérjéjének tekinthető. Mind az 1-es, mind a 2-es riboszomális klaszter olyan riboszomális fehérjéket tartalmaz, amelyekről korábban kimutatták, hogy szabályozzák az alternatív transzlációt (pl. RPL10A, RPL38, RPS19 és RPS25), és funkcionálisan befolyásolják a fejlődést (pl. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 A PCA eredményeivel összhangban, ezen riboszomális fehérjék rostokon keresztüli heterogén reprezentációja is folytonosságot mutatott (7C. kiegészítő ábra).
A heterogén riboszomális fehérjék riboszómán belüli elhelyezkedésének vizualizálásához az emberi 80S riboszóma szerkezeti modelljét használtuk (Protein Data Bank: 4V6X) (3E. ábra). Miután izoláltuk a különböző riboszomális klaszterekhez tartozó riboszomális fehérjéket, azok elhelyezkedése nem volt szorosan egy vonalban, ami arra utal, hogy megközelítésünk nem biztosította a riboszóma bizonyos régióinak/frakcióinak dúsítását. Érdekes módon azonban a 2. klaszterben a nagy alegység-fehérjék aránya alacsonyabb volt, mint az 1. és 3. klaszterben (7D. kiegészítő ábra). Megfigyeltük, hogy a vázizomrostokban megváltozott sztöchiometriájú fehérjék túlnyomórészt a riboszóma felszínén lokalizálódtak (3E. ábra), összhangban azzal a képességükkel, hogy kölcsönhatásba lépjenek a különböző mRNS-populációk belső riboszóma belépési helyének (IRES) elemeivel, ezáltal koordinálva a szelektív transzlációt.40, 41 Továbbá számos megváltozott sztöchiometriájú fehérje a vázizomrostokban funkcionális régiók közelében helyezkedett el, például az mRNS kilépési alagút közelében (3F. ábra), amelyek szelektíven szabályozzák a specifikus peptidek transzlációs megnyúlását és leállását. 42 Összefoglalva, adataink arra utalnak, hogy a vázizom riboszomális fehérjéinek sztöchiometriája heterogenitást mutat, ami különbségeket eredményez a vázizomrostok között.
Ezután a gyors és lassú összehúzódású rost-szignatúrák azonosítását, valamint transzkripciós szabályozásuk mechanizmusainak feltárását tűztük ki célul. A két adatkészletben (1G–H. és 4A–B. ábrák) az UMAP által meghatározott gyors és lassú összehúzódású rostcsoportok összehasonlításával transzkriptomikai és proteomikai elemzések 1366, illetve 804 eltérő gyakoriságú jellemzőt azonosítottak (4A–B. ábrák, 9–12. kiegészítő adatkészletek). Megfigyeltük a várt különbségeket a szarkomerekkel (pl. tropomiozin és troponin), a gerjesztés-kontrakció kapcsolással (SERCA izoformák) és az energia-anyagcserével (pl. ALDOA és CKB) kapcsolatos szignatúrákban. Ezenkívül a fehérje ubiquitinációját szabályozó transzkriptumok és fehérjék eltérően expresszálódtak a gyors és lassú összehúzódású rostokban (pl. USP54, SH3RF2, USP28 és USP48) (4A–B. ábra). Továbbá az RP11-451G4.2 (DWORF) mikrobiális fehérjegén, amelyről korábban kimutatták, hogy eltérően expresszálódik a bárány izomrost típusai között43, és fokozza a SERCA aktivitást a szívizomban44, szignifikánsan fel volt szabályozva a lassú vázizomrostokban (4A. ábra). Hasonlóképpen, az egyes rostok szintjén jelentős különbségeket figyeltek meg az ismert szignatúrákban, mint például az anyagcserével kapcsolatos laktát-dehidrogenáz izoformák (LDHA és LDHB, 4C. ábra és 8A. kiegészítő ábra)45,46, valamint a korábban ismeretlen rosttípus-specifikus szignatúrákban (mint például az IRX3, USP54, USP28 és DPYSL3) (4C. ábra). Jelentős átfedés volt megfigyelhető a transzkriptomikai és proteomikai adatkészletek között a differenciálisan expresszált jellemzők között (8B. kiegészítő ábra), valamint egy szoros változás korreláció, amelyet főként a szarkomer jellemzők kifejezettebb differenciális expressziója vezérelt (8C. kiegészítő ábra). Figyelemre méltó, hogy egyes génjelek (pl. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) csak proteomikai szinten mutattak erős poszttranszkripciós szabályozást, és lassú/gyors rángatózású rosttípus-specifikus expressziós profillal rendelkeztek (8C. kiegészítő ábra).
A és B vulkándiagramok, amelyek az 1G–H ábrákon látható egyenletes sokaság-közelítési és vetítési (UMAP) diagramok által azonosított lassú és gyors klasztereket hasonlítják össze. A színes pontok azokat a transzkriptumokat vagy fehérjéket jelölik, amelyek FDR < 0,05 esetén szignifikánsan különböznek, a sötétebb pontok pedig azokat a transzkriptumokat vagy fehérjéket jelölik, amelyek logaritmikus változás > 1 esetén szignifikánsan különböznek. A kétirányú statisztikai elemzést a DESeq2 Wald-teszttel végeztük Benjamini–Hochberg által korrigált p-értékekkel (transzkriptomika), vagy a Limma lineáris modell módszerrel, empirikus Bayes-analízissel, majd Benjamini–Hochberg által korrigálva a többszörös összehasonlításokhoz (proteomika). C A lassú és gyors rostok között kiválasztott, eltérően expresszált gének vagy fehérjék szignatúradiagramjai. D A szignifikánsan eltérően expresszált transzkriptumok és fehérjék dúsulási elemzése. Az átfedő értékek mindkét adathalmazban dúsulnak, a transzkriptom értékek csak a transzkriptomban, a proteom értékek pedig csak a proteomban dúsulnak. A statisztikai elemzést a clusterProfiler csomaggal végeztük Benjamini–Hochberg által korrigált p-értékekkel. E. A SCENIC által azonosított rosttípus-specifikus transzkripciós faktorok, a SCENIC-ből származó szabályozó specificitási pontszámok és a rosttípusok közötti eltérő mRNS expresszió alapján. F. A lassú és gyors rostok között eltérően expresszált, kiválasztott transzkripciós faktorok profilalkotása.
Ezután elvégeztük a differenciálisan reprezentált gének és fehérjék túlreprezentáció-elemzését (4D. ábra, 13. kiegészítő adatkészlet). A két adatkészlet között eltérő jellemzők útvonal-dúsulása a várt különbségeket tárta fel, mint például a zsírsav-β-oxidáció és a ketonanyagcsere-folyamatok (lassú rostok), a miofilamentum/izom-összehúzódás (gyors és lassú rostok), valamint a szénhidrát-katabolikus folyamatok (gyors rostok). A szerin/treonin protein-foszfatáz aktivitása szintén emelkedett volt a gyors rostokban, amit olyan jellemzők vezéreltek, mint a szabályozó és katalitikus foszfatáz alegységek (PPP3CB, PPP1R3D és PPP1R3A), amelyekről ismert, hogy szabályozzák a glikogén-anyagcserét (47) (8D–E. kiegészítő ábrák). A gyors rostokban gazdag egyéb útvonalak közé tartoztak a feldolgozó (P-) testek (YTHDF3, TRIM21, LSM2) a proteomban (8F. kiegészítő ábra), amelyek potenciálisan részt vesznek a poszttranszkripciós szabályozásban (48), valamint a transzkripciós faktor aktivitás (SREBF1, RXRG, RORA) a transzkriptomban (8G. kiegészítő ábra). A lassú rostok oxidoreduktáz aktivitásban (BDH1, DCXR, TXN2) (8H. kiegészítő ábra), amidkötésben (CPTP, PFDN2, CRYAB) (8I. kiegészítő ábra), extracelluláris mátrixban (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (8J. kiegészítő ábra) és receptor-ligand aktivitásban (FNDC5, SPX, NENF) (8K. kiegészítő ábra) gazdagodtak.
A lassú/gyors izomrost-típus jellemzői mögött meghúzódó transzkripciós szabályozás további megértése érdekében transzkripciós faktor dúsulási analízist végeztünk a SCENIC49 (14. kiegészítő adatkészlet) segítségével. Számos transzkripciós faktor szignifikánsan feldúsult a gyors és a lassú izomrostok között (4E. ábra). Ez magában foglalt olyan transzkripciós faktorokat, mint a MAFA, amelyet korábban a gyors izomrost-fejlődéssel hoztak összefüggésbe,50 valamint számos olyan transzkripciós faktort, amelyeket korábban nem hoztak összefüggésbe az izomrost-típusspecifikus génprogramokkal. Ezek közül a PITX1, az EGR1 és a MYF6 voltak a leggazdagabb transzkripciós faktorok a gyors izomrostokban (4E. ábra). Ezzel szemben a ZSCAN30 és az EPAS1 (más néven HIF2A) voltak a leggazdagabb transzkripciós faktorok a lassú izomrostokban (4E. ábra). Ezzel összhangban a MAFA magasabb szinten expresszálódott a gyors izomrostoknak megfelelő UMAP régióban, míg az EPAS1 ellentétes expressziós mintázatot mutatott (4F. ábra).
Az ismert fehérjét kódoló gének mellett számos nem kódoló RNS-biotípus létezik, amelyek szerepet játszhatnak az emberi fejlődés és betegségek szabályozásában.51, 52 A transzkriptom adatkészletekben számos nem kódoló RNS mutat rosttípus-specificitást (5A. ábra és 15. kiegészítő adatkészlet), beleértve a LINC01405-öt is, amely nagymértékben specifikus a lassú rostokra, és amelyről kimutatták, hogy csökkent mennyiségben van jelen mitokondriális myopathiában szenvedő betegek izomszövetében.53 Ezzel szemben az RP11-255P5.3, amely az lnc-ERCC5-5 génnek felel meg (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, gyors rosttípus-specificitást mutat. Mind a LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), mind az RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) vázizom-specificitást mutat (9A–B kiegészítő ábrák), és 1 Mb-os genomiális környezetükön belül nincsenek ismert kontraktilis génjeik, ami arra utal, hogy specializált szerepet játszanak a rosttípusok szabályozásában, nem pedig a szomszédos kontraktilis gének szabályozásában. A LINC01405 és az RP11-255P5.3 lassú/gyors rosttípus-specifikus expressziós profilját RNAscope segítségével igazoltuk (5B–C ábrák).
A. A nem-kódoló RNS-transzkriptumok jelentősen szabályozottak a lassú és gyors összehúzódású izomrostokban. B. Reprezentatív RNAscope képek, amelyek a LINC01405 és az RP11-255P5.3 lassú és gyors összehúzódású rosttípus-specificitását mutatják. Lépték = 50 μm. C. Az izomrost-típusspecifikus nem-kódoló RNS-expresszió mennyiségi meghatározása RNAscope segítségével (n = 3 biopszia független egyénektől, a gyors és lassú izomrostok összehasonlítása minden egyénen belül). A statisztikai elemzést kétoldalú Student-féle t-próbával végeztük. A dobozdiagramok a mediánt, valamint az első és harmadik kvartilist mutatják, a bajuszvonalak a minimum és maximum értékekre mutatnak. D. De novo mikrobiális fehérjeazonosítási munkafolyamat (a BioRender.com segítségével készült). E. A LINC01405_ORF408:17441:17358 mikrobiális fehérje specifikusan a lassú vázizomrostokban expresszálódik (n = 5 biopszia független résztvevőktől, a gyors és lassú izomrostok összehasonlítása minden résztvevőn belül). A statisztikai elemzést Limm lineáris modellmódszerével, empirikus Bayes-megközelítéssel kombinálva végeztük, majd Benjamini-Hochberg módszerrel végeztük többszörös összehasonlításokat p-érték korrigálással. A dobozdiagramok a mediánt, az első és a harmadik kvartilist mutatják, a bajuszvonalak pedig a maximum/minimum értékekre mutatnak.
Újabban tanulmányok kimutatták, hogy számos feltételezett nem kódoló transzkriptum kódol átírt mikrobiális fehérjéket, amelyek közül néhány az izomműködést szabályozza.44, 55 A potenciálisan rosttípus-specificitású mikrobiális fehérjék azonosítása érdekében az 1000 rostból álló proteom adatkészletünket egy egyéni FASTA fájl segítségével kerestük át, amely az 1000 rostból álló transzkriptom adatkészletben található nem kódoló transzkriptumok (n = 305) szekvenciáit tartalmazta (5D. ábra). 22 különböző transzkriptumból 197 mikrobiális fehérjét azonosítottunk, amelyek közül 71 szabályozása eltérő volt a lassú és a gyors vázizomrostok között (9C. kiegészítő ábra és 16. kiegészítő adatkészlet). A LINC01405 esetében három mikrobiális fehérjeterméket azonosítottunk, amelyek közül az egyik hasonló lassú rostspecificitást mutatott, mint a transzkriptuma (5E. ábra és 9D. kiegészítő ábra). Így a LINC01405-öt egy olyan génként azonosítottuk, amely egy lassú vázizomrostokra specifikus mikrobiális fehérjét kódol.
Kifejlesztettünk egy átfogó munkafolyamatot az egyes izomrostok nagyléptékű proteomikai jellemzésére, és azonosítottuk a rostheterogenitás szabályozóit egészséges állapotokban. Ezt a munkafolyamatot annak megértésére alkalmaztuk, hogy a nemalin miopátiák hogyan befolyásolják a vázizomrostok heterogenitását. A nemalin miopátiák örökletes izombetegségek, amelyek izomgyengeséget okoznak, és az érintett gyermekeknél számos szövődménnyel járnak, beleértve a légzési distresszt, a gerincferdülést és a korlátozott végtagmobilitást. 19,20 A nemalin miopátiákban jellemzően a gének, például az aktin alfa 1 (ACTA1) patogén variánsai a lassú összehúzódású rostok miorobrast-összetételének dominanciáját eredményezik, bár ez a hatás heterogén. Egy figyelemre méltó kivétel a troponin T1 nemalin miopátia (TNNT1), amelyben a gyors rostok dominálnak. Így a nemalin miopátiákban megfigyelt vázizomrost-szabályozási zavar mögött meghúzódó heterogenitás jobb megértése segíthet feltárni ezen betegségek és az miorobrast-típus közötti összetett kapcsolatot.
Az egészséges kontrollcsoporthoz képest (n=3 csoportonként) az ACTA1 és TNNT1 génmutációval rendelkező nemalin miopátiás betegekből izolált miorostok jelentős miorost-atrófiát vagy -disztrófiát mutattak (6A. ábra, 3. kiegészítő táblázat). Ez jelentős technikai kihívásokat jelentett a proteomikai elemzés során a rendelkezésre álló anyag korlátozott mennyisége miatt. Ennek ellenére 272 vázizomrostban 2485 fehérjét tudtunk kimutatni. Miután rostonként legalább 1000 számszerűsített fehérjét szűrtünk, 250 rostot vetettünk alá későbbi bioinformatikai elemzésnek. A szűrés után átlagosan 1573 ± 359 fehérjét számszerűsítettünk rostonként (10A. kiegészítő ábra, 17–18. kiegészítő adatkészletek). Figyelemre méltó, hogy a rostméret jelentős csökkenése ellenére a nemalin miopátiás betegek mintáinak proteommélysége csak mérsékelten csökkent. Továbbá, ezen adatok saját FASTA-fájljainkkal (beleértve a nem kódoló transzkriptumokat is) történő feldolgozása lehetővé tette számunkra, hogy öt mikrobiális fehérjét azonosítsunk nemalin miopátiás betegek csontvázizomrostjaiban (19. kiegészítő adatkészlet). A proteom dinamikus tartománya szignifikánsan szélesebb volt, és a kontrollcsoportban lévő összes fehérje jól korrelált egy korábbi 1000 rostból álló proteomanalízis eredményeivel (10B–C. kiegészítő ábra).
A. Mikroszkópos képek, amelyek rostsorvadást vagy -disztrófiát, valamint a különböző rosttípusok dominanciáját mutatják MYH alapján ACTA1 és TNNT1 nemalin myopathiákban (NM). Lépték = 100 μm. Az ACTA1 és TNNT1 betegek festésének reprodukálhatóságának biztosítása érdekében három beteg biopsziáját két-három alkalommal festették meg (négy metszetet esetenként), mielőtt reprezentatív képeket választottak volna ki. B. Rosttípus-arányok a résztvevőknél a MYH alapján. C. A vázizomrostok főkomponens-elemzéses (PCA) diagramja nemalin myopathiás betegekben és a kontrollcsoportban. D. Nemalin myopathiás betegek és a kontrollcsoport vázizomrostjai a 2. ábrán elemzett 1000 rostból meghatározott PCA diagramra vetítve. Például vulkándiagramok, amelyek összehasonlítják az ACTA1 és TNNT1 nemalin myopathiás résztvevők és a kontrollcsoport, valamint az ACTA1 és TNNT1 nemalin myopathiás résztvevők közötti különbségeket. A színes körök azokat a fehérjéket jelölik, amelyek π < 0,05 értéknél szignifikánsan különböztek, a sötét pontok pedig azokat a fehérjéket, amelyek FDR < 0,05 értéknél szignifikánsan különböztek. A statisztikai elemzést Limma lineáris modell módszerrel és empirikus Bayes-módszerekkel végeztük, majd p-érték korrigálással többszörös összehasonlításokhoz Benjamini-Hochberg módszerrel. H. A szignifikánsan eltérően expresszált fehérjék dúsulási analízise a teljes proteomban, valamint az 1-es és 2A típusú rostokban. A statisztikai elemzést a clusterProfiler csomaggal és Benjamini-Hochberg által korrigált p-értékekkel végeztük. I, J. Főkomponens-analízis (PCA) grafikonok extracelluláris mátrix és mitokondriális gén ontológia (GO) kifejezésekkel színezve.
Mivel a nemalin miopátiák befolyásolhatják a MYH-t expresszáló miorobarb típusok arányát a vázizomzatban,19,20 először a MYH-t expresszáló miorobarb típusokat vizsgáltuk nemalin miopátiás betegekben és kontrollcsoportban. Az miorobarb típusát egy korábban az 1000 miorobarb assay-hez leírt elfogulatlan módszerrel határoztuk meg (10D–E. kiegészítő ábrák), és ismét nem sikerült azonosítanunk a tiszta 2X miorobarbokat (6B. ábra). A nemalin miopátiák heterogén hatását figyeltük meg az miorobarb típusára, mivel két ACTA1 mutációval rendelkező betegnél megnövekedett az 1-es típusú miorobarbok aránya, míg két TNNT1 nemalin miopátiában szenvedő betegnél csökkent az 1-es típusú miorobarbok aránya (6B. ábra). Valóban, a MYH2 és a gyors troponin izoformák (TNNC2, TNNI2 és TNNT3) expressziója csökkent az ACTA1-nemalin miopátiákban, míg a MYH7 expressziója csökkent a TNNT1-nemalin miopátiákban (11A. kiegészítő ábra). Ez összhangban van a nemalin miopátiákban előforduló heterogén miorobarb típusváltásról szóló korábbi jelentésekkel.19,20 Ezeket az eredményeket immunhisztokémiával is megerősítettük, és azt találtuk, hogy az ACTA1-nemalin miopátiában szenvedő betegeknél az 1-es típusú miorobartok domináltak, míg a TNNT1-nemalin miopátiában szenvedő betegeknél az ellenkező mintázat mutatkozott (6A. ábra).
Az egyrostos proteom szintjén az ACTA1 és TNNT1 nemalin miopátiás betegek vázizomrostjai a kontrollrostok többségével csoportosultak, ahol a TNNT1 nemalin miopátiás rostok voltak általában a legsúlyosabban érintettek (6C. ábra). Ez különösen akkor volt nyilvánvaló, amikor az egyes betegek pszeudo-felfújt rostjainak főkomponens-elemzési (PCA) diagramjait ábrázoltuk, ahol a TNNT1 nemalin miopátiás 2. és 3. beteg tűnt a legtávolabb a kontrollmintáktól (11B. kiegészítő ábra, 20. kiegészítő adatkészlet). Annak érdekében, hogy jobban megértsük, hogyan viszonyulnak a miopátiás betegek rostjai az egészséges rostokhoz, az egészséges felnőtt résztvevők 1000 rostjának proteomikai elemzéséből származó részletes információkat használtuk fel. A miopátia adatkészletből (ACTA1 és TNNT1 nemalin miopátiás betegek és kontrollok) származó rostokat kivetítettük az 1000 rostos proteomikai elemzésből kapott PCA diagramra (6D. ábra). A MYH rosttípusok eloszlása a PC2 mentén a kontrollrostokban hasonló volt az 1000 rostos proteomikai elemzésből kapott rosteloszláshoz. A nemalin miopátiában szenvedő betegekben a legtöbb rost a PC2 irányába tolódott el, átfedésben az egészséges gyors összehúzódású rostokkal, függetlenül azok natív MYH rosttípusától. Így, bár az ACTA1 nemalin miopátiában szenvedő betegek az 1-es típusú rostok felé tolódást mutattak a MYH-alapú módszerekkel történő kvantifikálás során, mind az ACTA1 nemalin miopátia, mind a TNNT1 nemalin miopátia a vázizomrost proteomját a gyors összehúzódású rostok felé tolta el.
Ezután közvetlenül összehasonlítottuk az egyes betegcsoportokat az egészséges kontrollcsoportokkal, és 256, illetve 552 eltérően expresszált fehérjét azonosítottunk az ACTA1 és a TNNT1 nemalin miopátiákban (6E–G. ábra és 11C. kiegészítő ábra, 21. kiegészítő adatkészlet). A géndúsulási analízis a mitokondriális fehérjék összehangolt csökkenését mutatta ki (6H–I. ábra, 22. kiegészítő adatkészlet). Meglepő módon, az ACTA1 és a TNNT1 nemalin miopátiákban a rosttípusok eltérő dominanciája ellenére ez a csökkenés teljesen független volt a MYH-alapú rosttípustól (6H. ábra és 11D–I. kiegészítő ábrák, 23. kiegészítő adatkészlet). Három mikrobiális fehérje is szabályozódott az ACTA1 vagy a TNNT1 nemalin miopátiákban. Ezen mikroproteinek közül kettő, az ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 vagy Lnc-FOXO1 néven is ismert) és az ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), csak az 1-es típusú miorostokban mutatott eltérő gyakoriságot. Az ENSG00000215483_TR14_ORF67-ről korábban kimutatták, hogy szerepet játszik a sejtciklus szabályozásában.56 Másrészt az ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798-nak felel meg) szintje mind az 1-es, mind a 2A típusú miorostokban megemelkedett volt ACTA1-nemalin miopátiában az egészséges kontrollokhoz képest (12A. kiegészítő ábra, 24. kiegészítő adatkészlet). Ezzel szemben a riboszomális fehérjéket nagyrészt nem befolyásolta a nemalin miopátia, bár az RPS17 szabályozása csökkent az ACTA1 nemalin miopátiában (6E. ábra).
A dúsulási analízis az immunrendszeri folyamatok felregulációját is kimutatta ACTA1 és TNNT1 nemalin miopátiákban, míg a sejtadhézió is megnövekedett volt TNNT1 nemalin miopátiában (6H. ábra). Ezen extracelluláris faktorok feldúsulását az extracelluláris mátrixfehérjék tükrözték, amelyek a PCA-t negatív irányba (azaz a leginkább érintett rostok felé) tolták el a PC1-ben és a PC2-ben (6J. ábra). Mindkét betegcsoport az immunválaszokban és a szarkolemmális javítómechanizmusokban részt vevő extracelluláris fehérjék, például az annexinek (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 és a velük kölcsönhatásba lépő S100A1159 fehérje fokozott expresszióját mutatta (12B–C. kiegészítő ábrák). Korábban arról számoltak be, hogy ez a folyamat fokozott izomdisztrófiákban60, de tudomásunk szerint korábban nem hoztak összefüggésbe nem nemalin miopátiákkal. Ennek a molekuláris apparátusnak a normális működése szükséges a sérülés utáni szarkolemmális javításhoz, valamint az újonnan képződött myociták és az miorostok fúziójához58,61. Így a folyamat fokozott aktivitása mindkét betegcsoportban a mioroiberek instabilitása által okozott sérülésre adott reparatív válaszra utal.
Az egyes nemalin miopátiák hatásai jól korreláltak (r = 0,736) és ésszerű átfedést mutattak (11A–B kiegészítő ábrák), ami azt jelzi, hogy az ACTA1 és a TNNT1 nemalin miopátia hasonló hatással van a proteomra. Egyes fehérjék azonban csak az ACTA1 vagy a TNNT1 nemalin miopátiában voltak szabályozva (11A és C kiegészítő ábrák). Az MFAP4 profibrotikus fehérje volt az egyik leginkább felregulált fehérje a TNNT1 nemalin miopátiában, de változatlan maradt az ACTA1 nemalin miopátiában. Az SKIC8, a PAF1C komplex HOX gén transzkripciójának szabályozásáért felelős összetevője, leregulálódott a TNNT1 nemalin miopátiában, de az ACTA1 nemalin miopátia nem befolyásolta (11A kiegészítő ábra). Az ACTA1 és a TNNT1 nemalin miopátia közvetlen összehasonlítása a mitokondriális fehérjék nagyobb mértékű csökkenését és az immunrendszeri fehérjék növekedését mutatta ki TNNT1 nemalin miopátia esetén (6G–H. ábra és 11C. és 11H–I. kiegészítő ábrák). Ezek az adatok összhangban vannak a TNNT1 nemalin miopátiában megfigyelt nagyobb mértékű atrófiával/disztrófiával a TNNT1 nemalin miopátiához képest (6A. ábra), ami arra utal, hogy a TNNT1 nemalin miopátia a betegség súlyosabb formáját képviseli.
Annak felmérésére, hogy a nemalin miopátia megfigyelt hatásai az egész izom szintjén fennmaradnak-e, tömeges proteomikai elemzést végeztünk ugyanazon TNNT1 nemalin miopátiás betegek csoportjából származó izombiopsziákon, és összehasonlítottuk azokat a kontrollcsoporttal (n = 3 csoportonként) (13A. kiegészítő ábra, 25. kiegészítő adatkészlet). A várakozásoknak megfelelően a kontrollcsoport szorosan összefüggött a főkomponens-elemzésben, míg a TNNT1 nemalin miopátiás betegek nagyobb minták közötti variabilitást mutattak, hasonlóan az egyszálú analízisben megfigyelthez (13B. kiegészítő ábra). A tömeges elemzés reprodukálta az egyes rostok összehasonlításával kiemelt, eltérően expresszált fehérjéket (13C. kiegészítő ábra, 26. kiegészítő adatkészlet) és biológiai folyamatokat (13D. kiegészítő ábra, 27. kiegészítő adatkészlet), de elvesztette a különböző rosttípusok megkülönböztetésének képességét, és nem vette figyelembe a rostok közötti heterogén betegséghatásokat.
Összefoglalva, ezek az adatok azt mutatják, hogy az egymikrost-proteomika képes megvilágítani azokat a klinikai biológiai jellemzőket, amelyek célzott módszerekkel, például immunblottal nem detektálhatók. Továbbá ezek az adatok rávilágítanak az aktin rost tipizálás (MYH) önmagában történő használatának korlátaira a fenotípusos adaptáció leírására. Valójában, bár a rosttípus-váltás eltér az aktin és a troponin nemalin myopathiák között, mindkét nemalin myopathia elválasztja a MYH rost tipizálást a vázizomrostok anyagcseréjétől egy gyorsabb és kevésbé oxidatív izomproteom felé.
A sejtek heterogenitása kritikus fontosságú ahhoz, hogy a szövetek megfeleljenek változatos igényeiknek. A vázizomzatban ezt gyakran úgy írják le, mint a különböző erőtermelési fokú és fáradékonysági rosttípusokat. Azonban egyértelmű, hogy ez a vázizomrostok variabilitásának csak kis részét magyarázza, amely sokkal változatosabb, összetettebb és sokrétűbb, mint korábban gondolták. A technológiai fejlődés mára fényt derített a vázizomrostokat szabályozó tényezőkre. Valójában adataink arra utalnak, hogy a 2X típusú rostok nem feltétlenül egy különálló vázizomrost altípust képviselnek. Ezenkívül a metabolikus fehérjéket, a riboszomális fehérjéket és a sejtekhez kapcsolódó fehérjéket azonosítottuk a vázizomrostok heterogenitásának fő meghatározóiként. Proteomikai munkafolyamatunk fonálféreg-miopátiában szenvedő betegmintákra történő alkalmazásával tovább bizonyítottuk, hogy a MYH-alapú rosttípus-meghatározás nem tükrözi teljes mértékben a vázizom heterogenitását, különösen akkor, ha a rendszer zavart szenved. Valójában, a MYH-alapú rosttípustól függetlenül, a fonálféreg-miopátia a gyorsabb és kevésbé oxidatív rostok felé való eltolódást eredményez.
A vázizomrostokat a 19. század óta osztályozzák. A legújabb omikai elemzések lehetővé tették számunkra, hogy elkezdjük megérteni a különböző MYH rosttípusok expressziós profiljait és válaszaikat a különböző ingerekre. Amint itt leírtuk, az omikai megközelítéseknek az az előnyük is van, hogy nagyobb érzékenységgel számszerűsítik a rosttípus-markereket, mint a hagyományos antitest-alapú módszerek, anélkül, hogy egyetlen (vagy néhány) marker számszerűsítésére támaszkodnának a vázizomrost-típus meghatározásához. Kiegészítő transzkriptomikai és proteomikai munkafolyamatokat alkalmaztunk, és az eredményeket integráltuk az emberi vázizomrostok rostheterogenitásának transzkripciós és poszttranszkripciós szabályozásának vizsgálatára. Ez a munkafolyamat azt eredményezte, hogy nem sikerült tiszta 2X típusú rostokat azonosítani fehérje szinten az egészséges fiatal férfiak kohorszának vastus lateralisában. Ez összhangban van a korábbi, egyetlen rostot vizsgáló vizsgálatokkal, amelyek <1% tiszta 2X rostokat találtak az egészséges vastus lateralisban, bár ezt a jövőben más izmokban is meg kell erősíteni. Rejtélyes az eltérés a közel tiszta 2X rostok mRNS-szinten történő kimutatása és a csak kevert 2A/2X rostok fehérjeszinten történő kimutatása között. A MYH izoforma mRNS expressziója nem cirkadián,67 ami arra utal, hogy valószínűtlen, hogy „elmulasztottuk” a MYH2 megjelenési jelét a látszólag tiszta 2X rostokban RNS szinten. Az egyik lehetséges magyarázat, bár tisztán hipotetikus, a fehérje- és/vagy mRNS-stabilitásbeli különbségek lehetnek a MYH izoformák között. Valójában egyetlen gyors rost sem 100%-ban tiszta egyetlen MYH izoforma esetében sem, és nem világos, hogy a 70–90%-os tartományba eső MYH1 mRNS expressziós szintek egyenlő MYH1 és MYH2 bőséget eredményeznének-e fehérje szinten. Azonban, ha a teljes transzkriptomot vagy proteomot vesszük figyelembe, a klaszteranalízis magabiztosan csak két különálló klasztert tud azonosítani, amelyek a lassú és a gyors vázizomrostokat képviselik, függetlenül azok pontos MYH összetételétől. Ez összhangban van az egymagvú transzkriptomikai megközelítéseket alkalmazó elemzésekkel, amelyek jellemzően csak két különálló mionukleáris klasztert azonosítanak.68, 69, 70 Továbbá, bár a korábbi proteomikai vizsgálatok azonosították a 2X típusú rostokat, ezek a rostok nem klasztereződnek külön a többi gyors rosttól, és csak kis számú, eltérő bőségű fehérjét mutatnak a MYH-n alapuló más rosttípusokhoz képest. 14 Ezek az eredmények arra utalnak, hogy vissza kell térnünk az izomrostok 20. század eleji osztályozási nézetéhez, amely az emberi vázizomrostokat nem három különálló osztályba osztotta az MYH alapján, hanem két klaszterbe metabolikus és összehúzódási tulajdonságaik alapján. 63
Ennél is fontosabb, hogy az izomrostok heterogenitását több dimenzió mentén kell vizsgálni. Korábbi „omika” tanulmányok ebbe az irányba mutattak, azt sugallva, hogy a vázizomrostok nem alkotnak különálló klasztereket, hanem egy folytonosság mentén rendeződnek el. 11, 13, 14, 64, 71 Itt bemutatjuk, hogy a vázizom összehúzódási és metabolikus tulajdonságainak különbségei mellett az izomrostok megkülönböztethetők a sejtek közötti interakciókkal és a transzlációs mechanizmusokkal kapcsolatos jellemzők alapján is. Valóban, riboszóma-heterogenitást találtunk a vázizomrostokban, amely a lassú és gyors rosttípustól függetlenül hozzájárul a heterogenitáshoz. Ennek a jelentős izomrost-heterogenitásnak a kiváltó oka, amely független a lassú és gyors rosttípustól, továbbra sem tisztázott, de utalhat az izomrostokon belüli specializált térbeli szerveződésre, amely optimálisan reagál a specifikus erőkre és terhelésekre,72 az izom mikro-környezetében található más sejttípusokkal való specializált sejtes vagy szervspecifikus kommunikációra73,74,75 vagy az egyes izomrostokon belüli riboszóma-aktivitás különbségeire. Valóban, a riboszomális heteroplazmatika, akár az RPL3 és RPL3L paralóg szubsztitúcióján, akár az rRNA 2'O-metilációjának szintjén, összefüggésben áll a vázizom-hipertrófiával76,77. A multi-omikus és térbeli alkalmazások, az egyes izomrostok funkcionális jellemzésével kombinálva, tovább fogják elősegíteni az izombiológia multi-omikus szintű megértését78.
A nemalin miopátiában szenvedő betegek egyedi miorostjainak proteómáinak elemzésével igazoltuk az egyedi miorost proteomika hasznosságát, hatékonyságát és alkalmazhatóságát a vázizomzat klinikai patofiziológiájának tisztázásában. Továbbá, a munkafolyamatunkat a globális proteomikai elemzéssel összehasonlítva kimutathattuk, hogy az egyedi miorost proteomika ugyanolyan mélységű információt szolgáltat, mint a globális szöveti proteomika, és ezt a mélységet kiterjeszti az interrost heterogenitás és a miorost típus figyelembevételével. Az ACTA1 és TNNT1 nemalin miopátiákban az egészséges kontrollokhoz képest megfigyelt rosttípus-arány várható (bár változó) különbségei mellett19 oxidatív és extracelluláris átrendeződést is megfigyeltünk a MYH által közvetített rosttípus-váltástól függetlenül. Korábban már beszámoltak fibrózisról TNNT1 nemalin miopátiákban.19 Elemzésünk azonban erre a megállapításra épít, és feltárja az extracellulárisan kiválasztott stresszel kapcsolatos fehérjék, például az annexinek szintjének emelkedését is, amelyek részt vesznek a szarkolemma javítási mechanizmusaiban, az ACTA1 és TNNT1 nemalin miopátiában szenvedő betegek miorrostjaiban.57,58,59 Összefoglalva, a nemalin miopátiában szenvedő betegek miorrostjaiban a megnövekedett annexinszint a súlyosan atrófiás miorrostok helyreállítására irányuló sejtes választ jelezhet.
Bár ez a tanulmány a mai napig a legnagyobb, egyetlen rostból álló, teljes izom-omika elemzést jelenti embereken, nem korlátok nélküli. Viszonylag kis és homogén résztvevői mintából és egyetlen izomból (a vastus lateralisból) izoláltunk vázizomrostokat. Ezért lehetetlen kizárni a specifikus rostpopulációk létezését az izomtípusok között és az izomfiziológia szélsőséges eseteiben. Például nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy ultragyors rostok egy részhalmaza (pl. tiszta 2X rostok) jelenjen meg a magasan képzett sprintereknél és/vagy erősportolóknál79, vagy az izominaktivitás időszakaiban66,80. Továbbá a résztvevők korlátozott mintaelemszáma megakadályozta, hogy megvizsgáljuk a rostheterogenitás nemi különbségeit, mivel a rosttípus-arányokról ismert, hogy férfiak és nők között eltérőek. Továbbá nem tudtunk transzkriptomikai és proteomikai elemzéseket végezni ugyanazon izomrostokon vagy ugyanazon résztvevőktől származó mintákon. Ahogy mi és mások továbbra is optimalizáljuk az egysejtű és egymiofób elemzéseket omika analízis segítségével, hogy rendkívül alacsony mintabevitelt érjünk el (ahogyan azt itt a mitokondriális myopathiában szenvedő betegek rostjainak elemzése is mutatja), nyilvánvalóvá válik a multi-omika (és funkcionális) megközelítések kombinálásának lehetősége az egyes izomrostokon belül.
Összességében adataink azonosítják és megmagyarázzák a vázizomzat heterogenitásának transzkripciós és poszttranszkripciós mozgatórugóit. Konkrétan olyan adatokat mutatunk be, amelyek megkérdőjelezik a vázizomzat fiziológiájában régóta fennálló dogmát, amely a rosttípusok klasszikus MYH-alapú definíciójához kapcsolódik. Reméljük, hogy megújítjuk a vitát, és végső soron újragondoljuk a vázizomrostok osztályozásáról és heterogenitásáról alkotott ismereteinket.
Tizennégy kaukázusi résztvevő (12 férfi és 2 nő) egyezett bele önként a vizsgálatba. A vizsgálatot a Genti Egyetemi Kórház Etikai Bizottsága hagyta jóvá (BC-10237), az megfelelt a 2013-as Helsinki Nyilatkozatnak, és regisztrálva volt a ClinicalTrials.gov oldalon (NCT05131555). A résztvevők általános jellemzőit az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. A szóbeli és írásbeli tájékoztatáson alapuló beleegyezés megszerzése után a résztvevők orvosi vizsgálaton estek át a vizsgálatba való végleges beválasztás előtt. A résztvevők fiatalok (22–42 évesek), egészségesek (nem voltak egészségügyi problémáik, nem dohányoztak) és mérsékelten fizikailag aktívak voltak. A maximális oxigénfelvételt egy lépcsőergométerrel határoztuk meg a fizikai erőnlét felmérésére, a korábban leírtak szerint.81
Izombiopsziás mintákat gyűjtöttek nyugalmi és éhgyomorra, háromszor, 14 napos időközzel. Mivel ezeket a mintákat egy nagyobb vizsgálat részeként gyűjtötték, a résztvevők placebót (laktózt), H1-receptor antagonistát (540 mg fexofenadint) vagy H2-receptor antagonistát (40 mg famotidint) fogyasztottak 40 perccel a biopszia előtt. Korábban kimutattuk, hogy ezek a hisztamin receptor antagonisták nem befolyásolják a nyugalmi vázizomzat fittségét81, és a minőségellenőrzési diagramjainkon sem figyeltünk meg állapotfüggő csoportosulást (3. és 6. kiegészítő ábra). Minden kísérleti nap előtt 48 órán át standardizált étrendet (41,4 kcal/testtömegkg, 5,1 g/testtömegkg szénhidrát, 1,4 g/testtömegkg fehérje és 1,6 g/testtömegkg zsír) tartottak, és a kísérleti nap reggelén standardizált reggelit (1,5 g/testtömegkg szénhidrát) fogyasztottak. Helyi érzéstelenítésben (0,5 ml 1%-os lidokain adrenalin nélkül) izombiopsziákat vettünk a vastus lateralis izomból perkután Bergström-aspirációval.82 Az izommintákat azonnal RNAlaterbe ágyaztuk, és 4°C-on tároltuk a manuális rostboncolásig (legfeljebb 3 napig).
A frissen izolált miorost kötegeket friss RNAlater táptalajba helyeztük egy tenyésztőedénybe. Az egyes miorostokat ezután sztereomikroszkóp és finom csipesz segítségével manuálisan preparáltuk. Minden biopsziából huszonöt rostot preparáltunk, különös figyelmet fordítva arra, hogy a szálak a biopszia különböző területeiről kerüljenek kiválasztásra. A preparálás után minden rostot óvatosan 3 μl lízispufferbe (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) merítettünk, amely proteináz K és DNáz enzimeket tartalmazott a nem kívánt fehérjék és DNS eltávolítása érdekében. A sejtlízist és a fehérje/DNS eltávolítását ezután rövid vortexeléssel, a folyadék mikrocentrifugában történő forgatásával és szobahőmérsékleten történő inkubálással (10 perc) indítottuk el. A lizátumot ezután hőciklerben (T100, Bio-Rad) inkubáltuk 37°C-on 5 percig, 75°C-on 5 percig, majd azonnal -80°C-on tároltuk a további feldolgozásig.
Az Illumina-kompatibilis poliadenilezett RNS-könyvtárakat 2 µl miorbisz lizátumból készítettük a QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) segítségével. A részletes módszerek a gyártó kézikönyvében találhatók. A folyamat az első szálú cDNS szintézisével kezdődik reverz transzkripcióval, amelynek során egyedi molekuláris azonosítókat (UMI-kat) és minta-specifikus i1 vonalkódokat vezetnek be a minták összevonásának biztosítása és a technikai variabilitás csökkentése érdekében a downstream feldolgozás során. A 96 miorbiszból származó cDNS-t ezután összevonják és mágneses gyöngyökkel tisztítják, majd az RNS-t eltávolítják, és véletlenszerű primerek segítségével második szál szintézist végeznek. A könyvtárat mágneses gyöngyökkel tisztítják, pool-specifikus i5/i7 jelölőket adnak hozzá, és PCR-rel amplifikálják. Az utolsó tisztítási lépés Illumina-kompatibilis könyvtárakat eredményez. Az egyes könyvtárkészletek minőségét a High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500) segítségével értékelték.
A Qubit-kvantifikáció alapján a poolokat ekvimoláris koncentrációban (2 nM) tovább összevontuk. A kapott poolokat ezután NovaSeq 6000 készüléken szekvenáltuk standard módban, NovaSeq S2 reagenskészlet (1 × 100 nukleotid) felhasználásával 2 nM töltettel (4% PhiX).
A folyamatunk a Lexogen QuantSeq Pool adatelemző folyamatán alapul (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Az adatokat először a bcl2fastq2 (v2.20.0) programmal demultiplexeltük az i7/i5 index alapján. A 2. leolvasást ezután az idemux (v0.1.6) programmal demultiplexeltük az i1 minta vonalkódja alapján, majd az UMI szekvenciákat az umi_tools (v1.0.1) programmal vontuk ki. A leolvasásokat ezután a cutadapt (v3.4) programmal több körben megvágtuk, hogy eltávolítsuk a rövid leolvasásokat (<20 hosszúságú) vagy a kizárólag adapter szekvenciákból álló leolvasásokat. A leolvasásokat ezután a STAR (v2.6.0c) segítségével az emberi genomhoz illesztettük, a BAM fájlokat pedig a SAMtools (v1.11) segítségével indexeltük. A duplikált leolvasásokat az umi_tools (v1.0.1) segítségével távolítottuk el. Végül az igazítási számlálást a Subread (v2.0.3) featureCounts segítségével végeztük. A minőségellenőrzést FastQC (v0.11.9) segítségével végeztük a folyamat több közbenső szakaszában.
Minden további bioinformatikai feldolgozást és vizualizációt R (v4.2.3) nyelven végeztünk, elsősorban a Seurat (v4.4.0) munkafolyamatát használva.83 Ezért az egyes UMI-értékeket és metaadat-mátrixokat Seurat-objektumokká alakítottuk. Az összes rost kevesebb mint 30%-ában expresszált géneket eltávolítottuk. Az alacsony minőségű mintákat 1000 UMI-érték és 1000 detektált gén minimális küszöbértéke alapján távolítottuk el. Végül 925 rost ment át az összes minőségellenőrzési szűrési lépésen. Az UMI-értékeket a Seurat SCTransform v2 módszerrel normalizáltuk,84 beleértve mind a 7418 detektált jellemzőt, és a résztvevők közötti különbségeket regresszióval kiszűrtük. Minden releváns metaadat megtalálható a 28. kiegészítő adatkészletben.
Közzététel ideje: 2025. szeptember 10.